糖尿病小鼠腎小球微血管密度與VEGF表達的研究*

田河林，韋立順，許忠新，康艷輝，趙如同，金東嶺

(河北工程大學醫學院，河北 邯鄲 056029)

糖尿病微血管病變是糖尿病常見而嚴重的并發癥，是導致糖尿病患者生存質量下降的主要原因。新生血管的形成在糖尿病微血管病變的發生與發展過程中發揮重要作用。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管新生的主要促進因子［1］。微血管密度(microvessel density，MVD)是反映血管生成的生物指標，白細胞分化抗原CD34在血管內皮細胞有強陽性表達，是目前檢測微血管的可靠標記［2］。VEGF在糖尿病視網膜病變中的作用研究較為廣泛，VEGF在糖尿病腎病中的作用近年來日益受到關注。有關糖尿病腎小球VEGF表達與微血管密度關系的研究國內外鮮有報道。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導糖尿病小鼠模型，應用免疫組織化學方法觀察CD34和VEGF在糖尿病小鼠腎小球的表達，探討MVD與VEGF表達的關系，為糖尿病微血管病變的發病機制和干預措施提供依據。

材料和方法

1 動物

清潔級昆明種小鼠，雄性，30～35 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(冀)2008－1－008。

2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素購自Alexis;CD34單抗、VEGF單抗、SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。血糖儀及血糖試紙購自艾康生物技術(杭州)有限公司;CX41型Olympus顯微鏡。

3 主要方法

3.1 糖尿病模型建立與分組 所有動物飼養于室溫、12 h光/暗條件下，喂以鼠全價顆粒飼料，自由飲水，適應性飼養1周后開始實驗。將小鼠禁食(不禁水)12 h，稱重，尾尖取血測空腹血糖。實驗前用pH 4.4檸檬酸緩沖液將鏈脲佐菌素配成1%溶液。造模小鼠1次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(pH 4.5)150 mg/kg;對照組小鼠腹腔注射等容量檸檬酸緩沖液。72 h后測空腹血糖，空腹血糖高于16.7 mmol/L確定為造模成功糖尿病小鼠［3］。取糖尿病小鼠和正常對照小鼠各18只，分別飼養于鼠籠中，每籠6只。

3.2 標本采集與免疫組化染色 每周定時測量1次小鼠空腹體重與血糖，連續觀察6周。分別于第2、4、6周從糖尿病組和對照組中隨機抽取各6只小鼠，腹腔注射烏拉坦(1 g/kg)麻醉，摘取腎臟，以10%中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，連續4 μm切片，分別作HE染色和免疫組化染色。CD34及VEGF染色采用鏈酶親和素－過氧化物酶(streptavidin－peroxidase，SP)法，操作步驟按SP試劑盒說明書進行。3%H2O2室溫孵育，抗原熱修復，常規免疫組化標記，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。用PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。

3.3 結果觀察與判斷 取HE染色切片進行組織形態學觀察，采用組織細胞病理分析軟件進行計量學測定，在400倍視野下測量腎小球直徑、周長和面積，每張切片取5個腎小球，取其平均值。血管內皮細胞漿呈棕黃色染色為CD34染色陽性，單個血管內皮細胞或細胞簇染色陽性判定為1個微血管;在400倍視野下取5個腎小球計數微血管數目，取其平均值作為微血管密度值。細胞漿中出現棕黃色顆粒為VEGF表達陽性，按細胞染色強度計分(a):淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;按顯色細胞百分率計分(b):≤30%細胞顯色1分，31% －60%細胞顯色2分，≥61%細胞顯色3分;將2項得分的積作為VEGF表達指數(VEGF index)，即VEGF index=a×b［4］;在400倍視野下觀察，每張切片取5個腎小球，取其平均值作為VEGF index值。

4 統計學處理

結 果

1 一般狀況

對照組小鼠活動與精神狀態良好。糖尿病組小鼠活動減少，精神萎靡;攝食、飲水及排尿量明顯增多(數據略)，空腹血糖明顯高于對照組(P＜0.01)，見表1;造模后小鼠體重逐漸下降，第4、6周時體重顯著低于對照組(P＜0.01)，見表2。

表1 對照組與糖尿病組小鼠血糖水平變化Table 1.Changes of blood glucose level in control and diabetic mice(mmol/L.n=6)

表1 對照組與糖尿病組小鼠血糖水平變化Table 1.Changes of blood glucose level in control and diabetic mice(mmol/L.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 6.8 ±1.3 7.0 ±2.0 7.5 ±2.0 7.2 ±2.3 Diabetic 6.5 ±1.4 27.1 ±2.3＊＊26.5 ±2.7＊＊28.6 ±3.0＊＊

表2 對照組與糖尿病組小鼠體重變化Table 2.Changes of body weight in control and diabetic mice(g..n=6)

表2 對照組與糖尿病組小鼠體重變化Table 2.Changes of body weight in control and diabetic mice(g..n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

＊＊Control 36.2 ±2.2 38.5 ±2.1 40.2 ±2.8 42.3 ±2.6 Diabetic 37.1 ±2.6 36.7 ±2.3 32.4 ±3.0＊＊31.5 ±2.2

2 組織形態學

鏡下可見，糖尿病組小鼠腎小球明顯肥大，腎小球毛細血管數目增多，血管擴張，細胞外基質增多;腎髓質部分腎小管上皮細胞水腫，管腔擴張，內皮細胞數目增多，見圖1。組織細胞計量學測定結果表明，糖尿病組小鼠腎小球直徑、周長和面積均顯著大于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，見表3。

Figure 1.Histomorphological changes in glomeruli of control(A)and diabetic(B)mice 6 weeks after treatment(HE staining，×400).圖1 HE染色顯示對照組和糖尿病組小鼠腎小球組織形態學變化

表3 對照組與糖尿病組小鼠腎小球直徑、周長及面積變化Table 3.Changes of diameter，perimeter and area of glomeruli in control and diabetic mice(.n=6)

表3 對照組與糖尿病組小鼠腎小球直徑、周長及面積變化Table 3.Changes of diameter，perimeter and area of glomeruli in control and diabetic mice(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 48.8 ±8.3 49.0 ±8.7 50.1 ±9.1 19.1 ±3.3 19.1 ±3.1 19.0 ±4.0 20.1 ±7.2 20.1 ±6.2 20.3 ±7.2 Diabetic 56.7 ±9.2 72.3 ±8.5＊＊ 80.6 ±8.9＊＊ 23.5 ±3.5* 29.2 ±3.5＊＊ 31.2 ±3.9＊＊ 31.2 ±8.6* 50.4 ±10.2＊＊51.1 ±11.3＊＊

3 微血管密度與VEGF表達

與對照組相比，糖尿病組小鼠腎小球CD34染色在第2周時無明顯差異，第4周和第6周CD34染色明顯增強，見圖2，腎小球MVD顯著增大(P＜0.01)，見表4;糖尿病組小鼠腎小球VEGF表達在第2周時亦無明顯變化，第4周和第6周VEGF表達增強，見圖3，VEGF指數顯著高于對照組(P＜0.01)，見表4。相關性分析結果表明，糖尿病小鼠MVD值與VEGF 表達指數存在顯著正相關(r=0.9979，P ＜0.05)。

討 論

糖尿病是危害人類生命健康的慢性代謝性疾病，實驗性糖尿病動物模型的建立，不僅對研究糖尿病的病因和發病機制具有重要意義，而且為研究降糖藥作用機制及篩選降糖藥提供實驗依據。糖尿病動物模型大體分為實驗性、自發性和轉基因糖尿病模型，目前國內外應用較多的是注射STZ誘導的實驗性糖尿病動物模型。本實驗采用一次性腹腔注射STZ法，建立糖尿病小鼠模型。成模后小鼠出現多食、多飲、多尿及體重減輕等癥狀，其空腹血糖明顯高于16.7 mmol/L，且高血糖狀態持續至第6周而不下降，與文獻報道成模癥狀相符［5］。

Figure 2.Immunohistochemistry showed CD34 expression in glomeruli of control(A)and diabetic(B)mice 6 weeks after treatment(SP staining，×400).圖2 免疫組化染色顯示CD34在對照組和糖尿病組小鼠腎小球的表達

Figure 3.Immunohistochemistry showed VEGF expression in glomeruli of control(A)and diabetic(B)mice 6 weeks after treatment(SP stainning，×400).圖3 免疫組化染色顯示VEGF在對照組和糖尿病組小鼠腎小球的表達

表4 對照組與糖尿病組小鼠腎小球微血管密度及VEGF表達Table 4.Changes of MVD and VEGF expression of glomeruli in control and diabetic mice(.n=6)

表4 對照組與糖尿病組小鼠腎小球微血管密度及VEGF表達Table 4.Changes of MVD and VEGF expression of glomeruli in control and diabetic mice(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

VEGF index 2 weeks 4 weeks 6 weeks 2 weeks 4 weeks 6 weeks Control 14.1 ±2.2 14.6 ±2.9 15.2 ±2.6 2.4 ±1.2 2 Group MVD.4 ±1.1 2.5 ±1.3 Diabetic 16.3 ±2.7 21.7 ±2.4＊＊ 25.3 ±2.5＊＊ 3.6 ±1.4 6.1 ±1.5＊＊ 8.2 ±1.6＊＊

組織形態學觀察發現，糖尿病小鼠腎小球明顯肥大，腎小球直徑、周長及面積顯著大于對照組小鼠;并出現細胞外基質增多，腎小管上皮細胞水腫、管腔擴張等現象。高糖一直被認為是導致糖尿病腎臟形態及功能異常的主要原因，其機制之一是糖基化終產物的大量形成和聚積，引起腎小球多種細胞增生，導致腎小球肥大、細胞外基質增多和腎小球硬化;高糖還可能通過增加多元醇途徑活性、增加組織氧化應激過程或減少細胞外基質降解等多種途徑造成組織損害［6－7］。

免疫組化染色顯示，糖尿病小鼠腎小球CD34表達明顯增強，第4周后其微血管密度顯著高于正常對照組;同時，糖尿病小鼠腎小球VEGF表達顯著高于正常對照組。目前認為，多種細胞因子參與了糖尿病微血管病變的發生與發展過程，其中VEGF與糖尿病腎臟病變有密切聯系。VEGF是一種內皮細胞特異性絲裂原，廣泛分布于人和動物肝、腎、眼等多種組織，以旁分泌形式作用于內皮細胞相應受體，可刺激內皮細胞的增殖與分化，參與生理性和病理性新生血管形成，并增加微血管的通透性［8－9］。在糖尿病狀態下，高糖、糖基化終末產物、轉化生長因子β等多種因素均可促使VEGF的合成與分泌，VEGF表達的上調導致內皮細胞功能障礙和血管病變［10］。

VEGF在糖尿病視網膜病變中的作用已經明確，眼內VEGF水平高低與新生血管形成及視網膜病變嚴重程度密切相關。本研究結果發現，糖尿病小鼠腎小球新生血管生成增多，微血管密度增大，且與腎小球VEGF表達呈顯著正相關。在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中發現，VEGF在糖尿病早期(第3周)腎小球的表達即顯著增高［11］。臨床資料顯示，早期糖尿病患者腎小球上皮細胞VEGF表達上升;糖尿病患者血中VEGF水平較健康對照組和無微血管并發癥患者明顯增高［12］。顯然，VEGF表達上調與糖尿病腎臟微血管病變密切相關［13］。研究表明，高糖可誘導大鼠腎系膜細胞、牛視網膜細胞和人血管平滑肌細胞VEGF表達上調，其機制可能是通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)依賴途徑實現的，PKC抑制劑和VEGF抗體則可改善糖尿病腎臟病變［14－15］。

綜上所述，STZ誘導糖尿病小鼠腎小球明顯擴張，腎小球微血管密度顯著增加，且與腎小球VEGF表達呈顯著正相關，提示糖尿病腎臟病變與VEGF表達上調密切相關，抗VEGF治療可能成為糖尿病腎微血管病變新的防治措施。

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