牛磺酸對實驗性DM大鼠心臟保護作用的研究

張 喆，朱 寧，劉 莉，孫賀英，張永強，劉蘭瑞，馮建軍

(1河北大學基礎醫學院，河北保定 071000;2保定市第一中心醫院;3河北大學附屬醫院;4保定市疾病預防控制中心;5保定市第五醫院;6臨城縣人民醫院)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是臨床上的常見病、多發病。與非DM人群相比，DM患者各種心臟疾病如心絞痛、心律失常、心力衰竭等的發生率明顯增加，且這些并發癥也往往是導致患者最終死亡的重要原因。因此，保護DM患者心肌、延緩心肌損傷、防止各種并發癥發生對于提高生存質量、延長壽命顯得尤為重要。牛磺酸(Taurine)作為人體內條件必需氨基酸，是可興奮組織(神經、肌肉)細胞內含量最豐富的自由氨基酸。近年來牛磺酸與DM之間的關系受到高度重視。實驗研究與臨床資料表明，補充牛磺酸對DM神經病變、胰島素抵抗及心血管并發癥具有顯著防治作用［1，2］。2011年9月，我們觀察了牛磺酸對實驗性DM大鼠模型氧化應激損傷及心肌細胞凋亡的影響，旨在進一步探討牛磺酸對DM大鼠心臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠(軍事醫學科學院實驗動物中心)30只，適應性飼養1周;牛磺酸(上海伯奧生物技術公司)，鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司);葡萄糖試劑盒(中生北空生物科技股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)及大鼠誘導型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，原位細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL試劑盒，Roche公司)等。

1.2 動物分組與處理 將30只Wistar大鼠隨機分為對照組(CN組)、DM組、牛磺酸組(TAU組)各10只。其中后兩組均一次性尾靜脈注射2%的STZ(以pH值4.3的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液配制)45 mg/kg，繼續普通飼料喂養，1周后經內眥靜脈采血、以葡萄糖氧化酶法測定血糖，＞16.7 mmol/L者確定為DM制模成功［3］;其后TAU組以牛磺酸(30 g/L)生理鹽水溶液300 mg/(kg·d)灌胃，CN組、DM組予等體積生理鹽水灌胃，均連續8周。

1.3 血清氧化應激指標檢測 1.2實驗結束后，三組均用25%烏拉坦4 mL/kg麻醉，腹主動脈取5 mL血液，離心取上清，采用722型可見光分光光度計檢測MDA、SOD、NO水平，嚴格參照試劑盒說明書操作。

1.4 心肌組織iNOS活性及心肌細胞凋亡指數(Apoptotic index，AI)檢測 上述實驗結束后，三組均取下心臟，一部分心肌組織勻漿后參照試劑盒說明測定iNOS活性。另一部分心肌組織置于15%甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋，石蠟切片機常規切片，厚度約5 μm，切片后嚴格按照TUNEL檢測試劑盒說明書進行操作。凋亡細胞的細胞核呈現棕黃色，在普通光學顯微鏡下即可準確定位，每張切片隨機選取6個高倍視野，分別記數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數，以凋亡心肌細胞數占心肌細胞總數的百分比作為 AI［4］。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行統計學處理。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齊時多組間比較使用LSD法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 血清MDA、SOD、NO水平 與CN組比較，DM組血清MDA水平明顯增加(P＜0.01)，SOD活性顯著降低(P＜0.01)，NO水平升高(P＜0.05);與 DM組比較，TAU組血清 MDA水平降低(P＜0.05)，SOD活性提高(P＜0.05)，NO水平降低(P＜0.05)，見表1。

表1 三組血清MDA、SOD、NO水平比較(n=10，±s)

表1 三組血清MDA、SOD、NO水平比較(n=10，±s)

注:與 CN 組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與 DM 組比較，#P ＜0.05

組別 MDA(nmol/L) SOD(U/mL) NO(mmol/L)DM 組 8.31 ±1.75△ 0.65 ±0.22△ 109.53 ±20.41*TAU 組 4.09 ±1.18# 2.28 ±1.21# 74.87 ±19.72#CN組1.92 ±0.66 2.86 ±1.37 66.02 ±17.33

2.2 心肌組織iNOS活性與心肌細胞凋亡情況與CN組比較，DM組心肌組織iNOS活性明顯增高(P＜0.05)，心肌細胞 AI升高(P＜0.01);與 DM 組比較，TAU組心肌組織iNOS活性降低(P＜0.05)，且心肌細胞 AI降低(P＜0.01)，見表2。

表2 三組心肌組織iNOS、AI比較(n=10，±s)

表2 三組心肌組織iNOS、AI比較(n=10，±s)

注:與 CN 組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與 DM 組比較，#P ＜0.05，○P ＜0.01

組別 iNOS(μkat/g) AI(%)DM 組 31.61 ±6.29* 33.52 ±5.74△TAU 組 20.89 ±4.48# 15.49 ±3.53○CN組16.12 ±3.83 4.08 ±1.17

3 討論

心血管疾病是DM患者最常見的并發癥與死亡原因。長期高血糖不僅可引起血管損傷，同時也可直接損害心肌細胞。已有研究證實，高血糖能夠觸發活性氧族(Reactive oxygen species，ROS)引起氧化蛋白的修飾，增加氧化應激［5］;心肌是受ROS影響的主要器官之一，因此氧化應激在DM心肌損傷中起關鍵作用。體內的NO是一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)蛋白家族催化生成的具有雙向調節功能的氣態分子，參與多種生理與病理過程，如低濃度NO可增加心肌收縮力;而高濃度NO可產生負性變時效應，減弱心肌收縮力，增加NO來源的活性氮族(Reactive nitrogen species，RNS)如過氧化亞硝酸鹽的形成，產生廣泛細胞毒作用，參與組織損傷和疾病的發生。目前研究發現，NOS具有三種異構酶即神經型一氧化氮合酶(Neuronal NOS，nNOS)、內皮型一氧化氮合酶(Endothelial NOS，eNOS)和iNOS，其中eNOS和nNOS在哺乳動物的心肌持續表達;iNOS在正常生理狀態下低表達或表達缺陷，僅出現在收縮功能受損時損傷的心肌細胞［6］。本實驗發現，與CN組比較，DM組血清MDA水平顯著增高、SOD活性明顯下降、NO水平升高，心肌組織iNOS活性明顯增高;與DM組比較，TAU組血清MDA水平降低、SOD活性提高、NO水平降低，心肌組織iNOS活性明顯降低。表明DM大鼠體內脂質過氧化反應明顯，氧自由基清除功能下降;DM還可引起iNOS活性增高，促進產生高濃度NO，后者可增加氧化應激形成氧自由基進一步損傷心肌;牛磺酸能夠降低iNOS活性、增強SOD活性、減少MDA生成和降低NO濃度。證實牛磺酸具有明顯抗氧化、保護心肌的作用。

細胞凋亡是指在一定生理或病理條件下，受基因調控的自身程序性細胞死亡。目前認為，細胞凋亡失調參與許多重大疾病的發病，腫瘤發生、動脈粥樣硬化斑塊形成等均與細胞凋亡有密切關系［7］。同樣，細胞凋亡也是DM心肌破壞的一個重要形式，無論凋亡還是壞死均可導致心肌細胞質量和數量降低，最終損傷心功能，引起心血管系統并發癥［8］。本實驗顯示，與CN組比較，DM組心肌細胞AI顯著升高;與DM組比較，TAU組心肌細胞AI明顯降低。初步證實牛磺酸可以減少DM性心肌細胞凋亡。此可能繼發于其抗氧化功能(體內氧自由基過多可啟動細胞凋亡)，即牛磺酸可能通過降低iNOS活性、增強SOD活性減少氧自由基產生，進而抑制凋亡發生。但具體的機制如凋亡相關基因 Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因c-myc、抑癌基因p53等的表達變化以及更深層次的機制有待進一步研究。

綜上所述，牛磺酸對實驗性DM大鼠心臟具有保護作用，可能機制為減輕氧化應激損傷、減少心肌細胞凋亡。

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