非小細胞肺癌組織中Th17及CD4+CD25+Treg細胞的表達及意義

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，烏魯木齊 830011)

據統計，肺癌手術切除后的復發率高達50%，但目前臨床預測復發缺乏指標。腫瘤復發可能有宿主系統性應答的環節，其發揮的關鍵作用是對腫瘤微轉移的行為維持監測。現有大量的證據表明，免疫應答在維持疾病的免疫自穩方面，尤其是在疾病早期發揮著重要的免疫監視作用［1，2］。最近，許多研究者對調節性T細胞(Treg)的作用以及Th17細胞在以慢性炎癥為損傷機制的自身免疫疾病中的作用做了研究。當前的研究主要集中在Treg細胞、Th17細胞與I期NSCLC患者總體生存率之間的關系上。2008～2009年，我們檢測了非小細胞肺癌(NSCLC)組織中Th17細胞與CD4+CD25+Treg細胞相關產物 CD4、FoxP3、IL-17A的表達，分析其與NSCLC臨床病理參數的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集新疆醫科大學附屬腫瘤醫院非小細胞肺癌(NSCLC)根治手術標本102份，所有患者術前均未行放化療，均經病理證實診斷。患者男76例，女26例;年齡39～77歲。同時取癌組織及癌旁組織(距癌組織3～5cm)，標本均經10%中性福爾馬林固定≥8h，石蠟包埋。濃縮型鼠抗人FoxP3單克隆抗體購于香港Abcam公司，濃縮型鼠抗人IL-17A購于武漢博士德公司，EliVision兩步法免疫組化試劑盒及濃縮型鼠抗人CD4單克隆抗體均購于福州邁新公司。組織蠟塊均以4 μm厚度連續切片。

1.2 Th17細胞與CD4+CD25+Treg細胞相關產物檢測 采用EliVision兩步法。嚴格按照試劑盒說明操作。FoxP3、IL-17A均采用PH6.0檸檬酸鹽抗原修復液進行抗原修復;CD4取EDTA(PH9.0)抗原修復液于塑料修復盒中。FOXP3工作濃度1∶40，CD4工作濃度1∶40，IL-17A 工作濃度1∶100。切片、顯色、復染后用中性樹膠封片，由兩位病理醫師，采用雙盲法對免疫組化切片進行觀察。結果判斷標準:CD4陽性染色為細胞質/膜內有棕黃色顆粒，IL-17陽性染色為細胞質內有棕黃色顆粒，FoxP3陽性染色為細胞核內有棕黃色顆粒;細胞質/膜/核內無棕黃色顆粒或呈均勻一致淡黃色，與背景一致為(－)級;細胞質/膜/核內可見少量淡黃色顆粒，明顯高于背景為(±)級;細胞質/膜/核內可見較多深棕色顆粒為(+)級;細胞質/膜/核內可見大量深棕色顆粒為(++)級。(+)和(++)為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，分別采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗，P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 相關指標檢測結果 見表1。

表1 癌組織與癌旁組織中相關指標的表達情況

2.2 CD4、IL-17A及 FoxP3在 NSCLC中的表達見表2。

3 討論

理論上，Treg細胞可以通過衰減宿主的抗腫瘤T細胞下調免疫應答，可能導致腫瘤生長及繼發轉移。因此，原發腫瘤中Treg細胞的增加可能提示患者預后差。CD4+輔助T細胞(Th)在調控適應性免疫應答中發揮關鍵作用;新近發現的Th17細胞是一類具有很強促炎癥作用的新型輔助T細胞，在以慢性炎癥為損傷機制的自身免疫疾病中起重要作用;另有研究發現在某些實體腫瘤中Th17細胞數量增多，且與腫瘤的分期有關［3，4］;在 NSCLC 癌組織中，Th17細胞數量顯著升高，并分泌IL-17蛋白。目前關于Th17細胞與實體腫瘤關系的研究報道并不多，有研究發現在卵巢癌和腎癌組織中Th17細胞數量增多，甚至有報道在胃癌中Th17細胞的數量增多，且與腫瘤的分期有關［4，5］。本研究發現，NSCLC 癌組織中及周圍存在大量表達IL-17A蛋白的細胞，IL-17A的表達與腫瘤的病理分類、分級、分期，以及是否轉移等均無關，而與性別有關，可能與本研究女性病例較少有關。目前暫不清楚女性患者IL-17A的陽性表達強度高于男性患者的原因，尚待進一步研究。本研究結果顯示，NSCLC癌組織中及周圍存在大量CD4+T細胞，印證了初始CD4+T細胞在轉化生長因子β(TGF-β)單獨誘導下分化為CD4+CD25+Treg，分泌 TGF-β，參與免疫調節;在 TGF-β和IL-6的共同誘導下分化為Th17，分泌IL-6和IL-17，參與炎癥反應和自身免疫性疾病的結論［6］，亦提示腫瘤性疾病中也同樣適用此理論。

表2 CD4、IL-17A及FoxP3與NSCLC臨床病理參數的關系

由于CD4+CD25+Treg細胞可特異性地表達FoxP3轉錄因子，FoxP3轉錄因子對 CD4+CD25+Treg細胞的發育和行使功能起著重要作用，可作為其特異性標志［7］。有研究表明，肺鱗癌和肺腺癌患者的外周血中的CD4+CD25+Treg細胞比例均明顯高于非腫瘤患者;故有學者認為CD4+CD25+Treg有利于腫瘤免疫耐受的形成，可降低免疫系統對肺癌細胞的免疫應答，促進肺癌的發生和發展。本研究亦發現肺腺癌患者的FoxP3 mRNA表達高于肺鱗癌患者［8］;肺鱗狀細胞癌、肺腺癌以及腺鱗癌組織FoxP3的表達無顯著差異，因此暫不能認為FoxP3在各個肺非小細胞癌的病理類型中的表達有統計學意義。本研究發現，高分化NSCLC與低分化NSCLC之間Foxp3的表達強度有顯著性差異，可能與高分化NSCLC的標本量少有關，也可能與低分化NSCLC的Foxp3表達強度降低有關，還需要進一步證實。

本研究結果證實，CD4、FoxP3以及IL-17A等在肺癌組織中的表達均明顯高于癌旁組織，說明癌組織中有更多的CD4+CD25+Treg細胞以及Th17細胞浸潤，CD4+CD25+Treg細胞以及Th17細胞更容易被趨化到腫瘤組織并在腫瘤局部聚集，發揮其抑制效應。

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