裙帶菜多糖對人外周血單個核細胞的免疫活性作用

高淑清，張 輝，邸紅琴，趙連梅，單保恩

(1河北醫科大學第四醫院，石家莊 050011;2河北省胸科醫院)

裙帶菜(Undaria pinnatifida)是生活在海洋里的大型藻類，含有亞油酸和亞麻酸等人體必需的脂肪酸。近幾年的藥理研究表明裙帶菜多糖具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調節等多種生物活性［1］，顯示了其潛在的應用價值，但對其免疫調節機制尚不十分清楚。2006年10月～2008年3月，我們觀察了裙帶菜多糖對正常人外周血淋巴細胞增殖、淋巴細胞亞群等的影響，探討其免疫機制，旨在為臨床應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 CO2培養箱(TC 2323型)為美國SHELDON公司產品，倒置相差顯微鏡(LH50A型)使用日本OLYMPUS公司產品，酶標儀(HT2型)為奧地利Anthos公司，流式細胞儀(EPICS-XL型)使用Coulter Co.Healeah，FL產品。無菌培養板為美國Costar公司產品，Lymphocytes separation medium使用上海恒信化學試劑公司產品，MTT、DMSO和PHA購自Sigma公司，胎牛血清購自四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640使用美國GIBCO公司產品，淋巴細胞亞群流式檢測試劑盒購自CALTAGTM Laboratories公司。取10例健康志愿者靜脈血5mL，肝素抗凝備用。

1.2 方法

1.2.1 裙帶菜多糖提取物制備 采用多步分離法［2～4］對裙帶菜多糖的有效成分進行分離:首先用乙醇沉淀法提取粗多糖，然后應用葡聚糖凝膠Sephadex G-100過濾層析技術對粗多糖進行分離純化。采用苯酚—硫酸顯色法鑒定純化的多糖成份。得到單一的對稱峰(見圖1)，說明最終所得提取物為純多糖。

圖1 裙帶菜多糖粗提液經Sephadex G-100洗脫后的多糖含量曲線

1.2.2 PBMC分離 采用Ficoll密度梯度離心法。取5 mL肝素抗凝靜脈血與等量PBS液混勻，緩慢加于5 mL Ficoll淋巴細胞分離液面上，2 000 r/min離心20 min。取淋巴細胞加PBS液，1 500 r/min離心10 min，洗滌細胞2次。用含10%小牛血清的RPMI1640重懸細胞。用臺盼藍染色，計數淋巴細胞。活細胞百分率(%)=活細胞數/總細胞數×100%

1.2.3 PBMC干預及增殖活性檢測 取分離的PBMC，調整細胞濃度為21×106/mL，接種于96孔培養板，100 μL/每孔。每孔加入 PHA 1 μL(1 mg/mL)，使各孔PHA終濃度為5 μg/mL。觀察組分別加入0.5、5、20、100、500 μg/mL 的裙帶菜多糖，各設三個復孔;對照組僅加入PBS。用RPMI1640調整每孔終體積為200 μL。將培養板置于飽和濕度、5%CO2培養箱中37℃培養72 h。各培養孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL，繼續培養4 h。棄去培養上清，每孔加入 DMSO 100 μL，振蕩器震蕩反應 15 min。用酶聯免疫檢測儀以測定波長570 nm檢測各孔光密度(OD)值。

1.2.4 PBMC干預及淋巴細胞亞群表達檢測 取分離的PBMC，調整細胞濃度為1×106/mL，加入細胞培養瓶中，每瓶 2 mL。分別加入 0、0.5、5、20、100、500 μg/mL 的裙帶菜多糖 25 μL。同時，每瓶各加 PHA 5 μL(1 mg/mL，終濃度為 1 μg/mL)，用RPMI1640補足每瓶終體積為5 mL。于37℃、5%CO2培養箱中培養72 h，收獲各培養瓶中的細胞，用0.01 mol/L PBS洗1遍，調整細胞濃度為51×106/mL，用流式細胞儀檢測PBMC中淋巴細胞亞群。

1.3 統計學方法 采用SPSS14.0統計軟件對所有數據進行統計分析，實驗結果±s表示，組間比較采用成組設計的兩樣本均數比較的t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBMC 增殖活性 觀察組 0.5、5、20、100、500 μg/mL 干預后OD 值分別為0.136 ±0.036、0.191 ±0.023 、0.216 ± 0.007、0.193 ± 0.009、0.165 ±0.012，與對照組(0.106 ±0.006)比較，P 均 ＜0.01。2.2 淋巴細胞亞群 見表1。

表1 兩組淋巴細胞亞群水平(n=10，%，±s)

表1 兩組淋巴細胞亞群水平(n=10，%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與0.5 μg/mL 比較，▲P ＜0.05

組別 CD4+ CD8+ CD19+ CD16+CD56+觀察組0.5 μg/mL 49.50 ±1.80 24.67 ±1.53* 3.80 ±1.53 4.17 ±0.76 5.0 μg/mL 49.60 ±1.76 30.87 ±2.08△▲3.33 ±2.08 9.33 ±1.53△▲20.0 μg/mL 48.98 ±3.21 34.67 ±2.52△▲3.67 ±1.53 9.67 ±1.53△▲100.0 μg/mL 49.31 ±4.53 28.33 ±2.10△▲3.68 ±2.00 6.70 ±1.44△▲500.0 μg/mL 48.99 ±2.62 28.10 ±5.00＊▲3.80 ±2.69 5.50 ±1.80△對照組49.30 ±4.00 21.33 ±4.04 3.78 ±2.00 3.01 ±1.73

3 討論

裙帶菜為褐藻門昆布屬，是經濟價值和藥用價值較高的大型藻類，營養豐富。裙帶菜孢子葉含人體必需的八種氨基酸及亞油酸、亞麻酸等人體必需的脂肪酸(其中二十碳五烯酸占脂肪酸含量的15% ～20%)。另外，裙帶菜富含鈣、鎂、鐵等多種無機元素，是人體所需要的重要營養物質。被譽為海中的蔬菜、餐桌上的綠色保健食品。本研究采用多步分離法分離純化了裙帶菜多糖活性成分，裙帶菜多糖作為裙帶菜中的重要活性成分，研究其免疫學活性及作用機制具有十分重要的意義。本研究顯示，裙帶菜多糖可明顯增強PHA刺激的PBMC增殖，在一定濃度范圍內，隨裙帶菜多糖濃度的增加，PBMC增殖反應逐漸增強。但當裙帶菜多糖濃度增加到一定值時(100 μg/mL)，PBMC增殖又逐漸減弱。這可能是由于淋巴細胞在高濃度的裙帶菜多糖環境下，受到來自滲透壓、pH等的不利影響，而使細胞受到損害，從而影響細胞的存活和增殖。與以往的報道一致［5］。

CD8+T細胞主要包含兩類細胞即Ts細胞(抑制性T細胞)和CTL(殺傷性T細胞)。Ts細胞作用的靶細胞主要是抗原特異性的Th和B細胞，其作用除了引起細胞免疫應答外，還可抑制B細胞產生抗體;CTL的主要生物學主要為參與細胞免疫、抗腫瘤免疫及移植排斥反應。NK細胞是一種非特異性、具有細胞毒性的免疫細胞群，在宿主的免疫監視功能中具有重要作用。該細胞無需抗原預先致敏，就能自發地殺傷靶細胞，主要功能是參與細胞免疫，在腫瘤免疫、抗病毒感染中均起重要作用。NK細胞的抗腫瘤活性依賴KIR區域和TRAU區域介導腫瘤細胞凋亡，這兩個激活和抑制性受體的調節和平衡是腫瘤免疫治療的基礎［6］。Maruyama 等［7］對裙帶菜孢予葉中提取的巖藻聚糖進行研究，結果發現巖藻聚糖糖能夠提高Thl細胞應答及IFN-γ和IL-12產生，從而介導細胞免疫反應。本研究結果顯示，裙帶菜多糖刺激PBMC增殖后，各淋巴細胞亞群的表達發生明顯改變。其中CD8+T細胞、NK細胞比例明顯增高，CD4+T細胞雖有增加趨勢，但與對照組比較無顯著性差異，B細胞無明顯變化。提示裙帶菜多糖通過增強細胞免疫而非體液免疫功能發揮免疫作用。

綜上所述，裙帶菜多糖能夠促進人PBMC淋巴細胞增殖并對淋巴細胞亞群水平產生有益的影響。增強細胞免疫功能可能是裙帶菜多糖治療腫瘤機制之一。關于裙帶菜多糖對細胞因子分泌、體液免疫功能的影響、體內作用效果、抗腫瘤作用等有待于進一步研究。

［1］付小梅，高淑清，孫俠，等.裙帶菜的生理藥理作用研究進展［J］.癌變·畸變·突變，2004，16(4):254-256.

［2］王北嬰，李儀奎.中藥新藥研制開發技術與方法［M］.上海:上海科學技術出版社，2001:735-749.

［3］李亞清.小球藻多糖的分離純化和組成分析［J］.大連水產學院學報，2006，21(3):56-59.

［4］周文蘭，童列波.苯酚—硫酸法測定康克膠囊中多糖含量［J］.時珍國醫國藥，2001，12(7):505.

［5］胡國俊，白惠卿，杜守英.枸杞對TB淋巴細胞增殖和T細胞亞群變化的調節作用［J］.中國免疫學雜志，1995，11(3):163-165.

［6］Klinge N，Mann H，Boissel L.Targeted cellular therapy with natural killer cells［J］.Horm Metab Res，2008，40(2):122-125.

［7］Mamyama H，Tamauehi L，Hashimoto M，et al.Antitumor activity and immune response of mekabu fueoidan extracted from sporophy U of undaria pinnatifida［J］.In Vivo，2003，17(3):245.