氯胺酮對乳鼠海馬CA3區神經元凋亡及NMDAR-2B表達的影響

石永勇，賈 彬，招偉賢，李向宇，古妙寧

(1南方醫科大學附屬南方醫院，廣州 510515;2廣東省中醫院)

研究表明，發育中的大腦對氯胺酮非常敏感，持續暴露5 h即足以引起顯著的神經元凋亡［1］。氯胺酮 為 N-甲 基-D-天 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體拮抗劑，其引起發育中神經元凋亡的確切機制尚不清楚。2011年6月～2012年1月，我們觀察了氯胺酮對新生乳鼠海馬CA3區NMDA受體表達的影響，探討氯胺酮引起神經元凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 氯胺酮(批號:100407，福建古田藥業有限公司)，NMDAR-2B抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，凋亡試劑盒購自美國寶靈曼公司(批號:12469500)，MSHOT數碼成像系統(廣州市明美光電技術有限公司)，Olympus BX50顯微鏡(Olympus);12只新生7 d的SD大鼠，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及標本制作 12只SD大鼠用苦味酸標記后稱體質量，隨機分為氯胺酮組和對照組各6只。氯胺酮組腹腔注射氯胺酮20mg/kg，間隔90 min再次注射，共計5次;對照組于相應時間點腹腔注射等體積的生理鹽水。處理間隙將新生大鼠放回籠中，呼吸空氣。第一次注射24 h后，腹腔注射10%水合氯醛深麻醉后，以冰鹽水經心臟灌注，灌注至清水流出后以4%多聚甲醛灌注固定。斷頭取腦，修塊后固定于4%多聚甲醛中24 h以上。常規脫水，石蠟包埋，制作4 μm厚切片。

1.2.2 觀察項目 ①凋亡細胞密度:采用TUNNEL法。切片常規脫蠟至水，劃圈，入蒸餾水;切片放入0.1%TritonX100液室溫下8 min:流水沖洗2 min，入PBS洗1 min，3次;滴加標記混合物37度標記60 min;入PBS洗1 min，3次;滴加轉換液37℃處理30 min;入PBS洗1 min，3次;BCIP-NBT顯色液顯色10 min，流水沖洗3 min，擦去組織周圍水分，入PBS洗1 min，3次，GVA水溶性封片劑封片，常溫晾干。結果判定:凋亡小體呈黑色或紫藍色位于細胞核內。在200倍顯微鏡下計算凋亡細胞數，并采用用MIAS醫學圖像分析管理系統計算凋亡細胞密度。凋亡細胞密度=凋亡細胞數/統計場面積。②海馬神經元CA3區NMDA-2B受體表達:采用免疫組化法。切片經純二甲苯脫臘2次，每次6 min;梯度乙醇脫二甲苯各2 min;自來水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min;加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，室溫下作用10 min;切片放入已沸騰的檸檬酸修復液中，繼續加熱至溶液冒小氣泡但不沸騰為度，保持10 min;停止加熱，冷卻至室溫約15 min，流水沖洗，PBS液洗2次，擦干切片組織周圍表面水分劃圈;加入5%BSA封閉液，室溫下作用20 min;加入NMDA-2B抗體(1∶40)，37℃恒溫箱內1 h;PBS沖洗，3 min ×3次，滴加生物素化二抗，37℃恒溫箱內20 min;PBS沖洗，3 min×3次，滴加鏈霉菌卵白素-辣根過氧化物酶，37℃恒溫箱內20 min;PBS洗后加入DAB，顯色1～5 min;蘇木素淺復染，常規脫水、封片，分析結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海馬CA3區元凋亡細胞密度 光鏡下可見凋亡細胞體積縮小，凋亡小體呈黑色或紫藍色位于細胞核內。對照組僅見少量散在的凋亡細胞(圖1A)，氯胺酮組可見較多染色質固縮，呈棕黃色的凋亡細胞(圖1B)。氯胺酮組和對照組大鼠的凋亡細胞密度分別為 3.252 ±2.330、1.053 ±0.562(P ＜0.05)。

圖1 氯胺酮麻醉對新生大鼠海馬CA3區神經元凋亡的影響(×200)

2.2 海馬CA3區NMDA-2B受體表達 NMDA受體陽性細胞呈散在均勻分布于海馬CA3區，DAB顯色呈棕黃色。與對照組相比，氯胺酮組陽性細胞明顯增多(圖2)。圖像分析發現對照組光密度值為15.38 ±3.72，氯胺酮組為22.25 ±1.64，兩組比較，P=0.0007。

圖2 氯胺酮對海馬CA3區NMDA受體表達的影響(×100)

3 討論

氯胺酮是惟一具有鎮痛作用的靜脈麻醉藥，由于其鎮痛作用強，對呼吸、循環系統影響輕，在小兒麻醉中得到廣泛應用［2，3］。但 1999 年 Ikonomidou等［4］在《科學》雜志報道了包括MK801和氯胺酮在內的NMDA受體拮抗劑可引起發育神經元廣泛凋亡后，引起了臨床對氯胺酮在小兒麻醉中應用安全性的擔憂。

NMDA受體是一種中樞神經系統興奮性氨基酸離子型受體，具有許多不同變構調控位點并對Ca2+高度通透。在中樞神經系統，NMDA受體主要分布在大腦皮層及海馬，尤其以海馬最為豐富。在中樞神經發育的過程中，NMDA受體通過不同亞型的選擇性表達而改變自身的結構和功能，進而影響NMDA受體介導的Ca2+內流，調節神經元內Ca2+依賴的第二信使系統，最終實現對中樞神經系統發育過程的復雜調控。在未成熟大腦中，NMDA受體活性對于神經元存活至關重要。既往研究表明，阻斷這些受體可引起新生動物神經細胞凋亡。

近年來的研究證實，年幼動物接受氯胺酮全身麻醉可引起大腦神經元凋亡，引起學習記憶功能損害［5］。本研究結果顯示，氯胺酮干預后大鼠海馬CA3區神經元的凋亡顯著增加;重復注射氯胺酮可引起新生大鼠海馬NMDA-2B受體表達明顯增加，與其他學者研究結果一致［6］。據此我們認為，長時間暴露于氯胺酮環境中可觸發發育中神經元凋亡增加，其機制可能與氯胺酮引起NMDA受體表達上調有關。

［1］Brambrink AM，Evers AS，Avidan MS，et al.Ketamine-induced neuroapoptosis in the fetal and neonatal rhesus macaque brain［J］.Anesthesiology，2012，116(2):372-384.

［2］劉俊鋒，崔萬紅.咪唑安定、氯胺酮口服在小兒手術基礎麻醉中的應用效果觀察［J］.山東醫藥，2010，50(34):103-104.

［3］張國生，武巧月，王娟，等.小劑量氯胺酮、瑞芬太尼在嬰幼兒唇腭裂手術中的麻醉效果觀察［J］.山東醫藥，2009，49(38):103-104.

［4］Ikonomidou C，Bosch F，Miksa M，et al.Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain［J］.Science，1999，283(5398):70-74.

［5］Hayashi H，Dikkes P，Soriano SG.Repeated Administration of Ketamine May lead to Neuronal Degeneration in the Developing Rat Brain［J］.Paediatric Anaesthesia，2002，12(9):770-774.

［6］Shi Q，Guo L，Patterson TA，et al.Gene expression profiling in the developing rat brain exposed to ketamine［J］.Neuroscience，2010，166(3):852-863.