美洲大蠊提取物誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡及作用機制

董京千，偉忠民，王 晶

(1遼寧醫學院，遼寧錦州 121000;2遼寧醫學院附屬第一醫院)

美洲大蠊屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂。用于藥物始載于《神農本草經》［1］。現代藥理研究表明美洲大蠊具有促進傷口愈合、組織修復作用;增強免疫、抗腫瘤作用;抗菌、抗炎、鎮痛、抗病毒作用;強心升壓、改善微循環作用［2］。近年來，人們對美洲大蠊藥用價值的研究越來越多，但有關美洲大蠊對肝癌細胞的作用及機制研究少有報道。2011年2月～2012年2月，我們觀察了美洲大蠊對人肝癌細胞增殖及凋亡作用的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株SMMC-7721由遼寧醫學院科學實驗中心提供。美洲大蠊(綿陽好醫生中藥飲片有限公司，順鉑(云南個舊生物藥業有限公司);DMEM培養基干粉購自GIBCO公司，小牛血清購自杭州四季清生物制品公司，胰蛋白酶購自Hyclcome公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Amresco公司)，AncxinV-FITC凋亡試劑盒(北京賽寶生物公司)，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、Caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。電子天平(北京塞多利斯天平有限公司)，旋轉蒸發儀(上海亞榮儀器廠)，超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器公司)，二氧化碳培養箱(Sheldon Manufacturing IncUSA)，超凈工作臺(江蘇吳縣市凈化技術研究所)，TDL-4型離心機(上海安亭科學儀器廠)，XD-101型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 美洲大蠊提取物制備 美洲大蠊40 g加入15倍量95%乙醇，3次冷浸提取，合并乙醇提取液，濾過，減壓濃縮回收乙醇，石油醚脫脂得提取浸膏［3］。

1.2.2 細胞培養 SMMC-7721細胞在5%CO2，37℃培養箱中用含10%小牛血清和DMEM完全培養基常規培養，每2 d換液1次，0.25%胰蛋白酶消化傳代，選用對數生長期狀態良好的細胞進行實驗［4］。

1.2.3 細胞干預及增殖抑制率(IR)檢測 取處于對數生長期狀態良好的SMMC-7721細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以DMEM完全培養基制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×105/mL。所有細胞隨機分為三組，觀察組接種到96孔板中，置培養箱中常規培養24 h后加入100 μL含有不同濃度的美洲大蠊提取物(DMEM培養基稀釋)，每種濃度設5個平行孔，終濃度分別為 300、100、33.3 μg/mL。順鉑組加入順鉑20 μg/mL作用于細胞48 h，常規收集細胞，PBS洗滌，重懸調整細胞濃度1×106/mL。對照組只加入培養基。分別置培養箱中常規培養24、48、72 h后，每孔加入MTT 20 μL，繼續孵育4 h，吸除上清，每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床上震蕩20 min使紫色結晶充分溶解后，酶標儀檢測570 nm處A值，重復實驗3次，計算IR。IR=(1－實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.4 細胞干預及細胞凋亡率檢測 細胞分組及處理同1.2.3。AncxinV-FITC結合液重懸細胞，按照試劑盒說明書操作進行，加入5 μL AncxinV-FITC和5 μL PI輕輕混勻，25℃鋁箔避光孵育10 min，上流式細胞儀檢測，重復3次，所得數據經Bioconsort專用軟件處理，分析細胞凋亡率。

1.2.5 細胞干預及細胞線粒體膜電位測定 細胞分組及處理同1.2.3。按照JC-1染色試劑盒操作說明經行，加入JC-1染色劑，使其終濃度為10 μg/mL。JC-1染色緩沖液洗滌2次，PBS重懸，進行流式檢測與分析線粒體膜電位變化。

1.2.6 細胞干預及Caspase-3活性檢測 取處于對數生長期狀態良好的SMMC-7721細胞，消化接種于25 mL培養瓶中，置培養箱中常規培養24 h后加入實驗組美洲大蠊提取物，終濃度分別為300、100、33.3 μg/mL，對照組加入順鉑 20 μg/mL 作用于細胞48 h，消化，離心，PBS洗滌細胞2次，重懸細胞使細胞濃度至5×106/mL。按照Caspase-3試劑盒說明操作，加入 Ac-DEVD-pNA 10 μL，上酶標儀405 nm處檢測Caspase-3活性。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。所得數據以±s表示。采用單因素方差分析和t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IR 見表1。

表1 各組不同時間點A值及IR比較

2.2 細胞凋亡率和細胞Caspase-3活性 見表2。

表2 各組細胞凋亡率和細胞Caspase-3活性比較(±s)

表2 各組細胞凋亡率和細胞Caspase-3活性比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 細胞凋亡率(%) Caspase-3活性(A值)觀察組33.3 μg/mL 12.34 ±0.98* 0.164 ±0.057*100 μg/mL 18.67 ±1.23* 0.237 ±0.039*300 μg/mL 26.38 ±1.14* 0.319 ±0.040*順鉑組 13.88 ±1.67* 0.086 ±0.032對照組1.56 ±0.86 0.082 ±0.012

2.3 細胞線粒體膜電位 各組細胞線粒體膜電位見圖1。由圖1可見，美洲大蠊提取物可以使細胞線粒體膜電位下降。隨著美洲大蠊提取物濃度的升高，細胞線粒體膜電位逐漸下降并呈現劑量依賴性，與對照組相比，P＜0.05。

圖1 美洲大蠊提取物對細胞線粒體膜電位的影響

3 討論

肝癌惡性程度高，易轉移復發，生存率低。放化療為肝癌目前的主要治療手段，但有明顯的毒副作用。現代藥理研究表明中醫藥在防治肝癌轉移、復發，提高生活質量以及特有的低毒，整體調節方面的綜合優勢。但是由于中藥的化學成分及作用機制仍然不十分明確，阻礙了進一步的研究和利用。

細胞凋亡是細胞生物體內的一個重要的生命現象，肝癌的發病機制與細胞凋亡和細胞增殖失衡有密切關系，癌細胞調亡減少導致肝癌迅速生長。中藥誘導腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的新途徑［5］。

國內外研究表明，美洲大蠊提取物體外能抑制多種腫瘤細胞生長。蔣永新等［6］研究表明美洲大蠊提取物有阻滯胃癌細胞周期抑制腫瘤生長，誘導胃腫瘤細胞凋亡的作用。美洲大蠊提取物作用于BGC-823細胞可使G2/M期細胞聚集，阻滯M/G1細胞轉換，S期細胞減少，干擾癌細胞DNA合成。細胞內外的許多因素可以誘導細胞發生凋亡。雖然這些因素和傳導途徑不同，但是細胞凋亡后期具有相同的Caspase激活。誘導細胞凋亡的主要核心通路有線粒體依賴性細胞通路和配體受體激活的Caspase依賴性細胞凋亡通路。細胞凋亡時線粒體通透性發生變化，線粒體腫脹，線粒體跨膜電位下降，ATP合成抑制，線粒體釋放凋亡誘導因子及細胞色素C，通過不同信號傳導途徑，激活Caspase級聯反應，產生具有活性的 Caspase-9再激活下游Caspase-3等效應Caspase，從而調控細胞凋亡［7］。

本實驗研究結果表明，美洲大蠊提取物抑制肝癌細胞生長并誘導細胞凋亡，隨著藥物濃度的增加，線粒體膜電位逐漸下降，Caspase-3蛋白被活化。提示線粒體途徑可能是美洲大蠊提取物誘導人肝癌細胞凋亡的主要機制之一，但具體的凋亡作用機制尚有待進一步研究。

［1］孫星衍.神農本草經［M］.北京:商務印書館，1955:90.

［2］He ZC，Peng F，Song LY，et al.Review on investigations related to chemical constituents and biological activities of periplaneta americana［J］.Chin J Chin Materia Med，2007，32(21):2326-2331.

［3］He ZC，Wang XY，Yang LX，et al.Research on digestive system tumor cytotoxicity of extractsfrom periplaneta americana［J］.Chn Pharm，2009，18(9):11-12.

［4］王玥，李應東.人肝癌SMMC-7721細胞培養體會［J］.中外醫療，2011，30(2):26-27.

［5］Hou W，Liang T，Zhou YM.Clinical progress in traditional chinese medicine for primary liver cancer［J］.J Oncol，2010，16(7):534-536

［6］Jiang YX，Wang XC，Jin CG，et al.An experimental study of traditional chinese medicine kangfuxin inducing apoptosis in vitro of peptic carcinoma cell line BGC-823［J］.J Kunming Med College，2006，27(2):5-9.

［7］沈方，沈倩.細胞調亡與線粒體通透性轉變孔的研究進展［J］.浙江大學學報(醫學版)，2005，34(2):191-196.