艾灸預處理對阿爾茨海默病模型大鼠海馬CA1區BDNF及其受體TrkB的影響

李 熙 孫國杰 王述菊 馬 駿 王彥春 張春麗 (湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(AD)治療方法僅能緩解癥狀，不能改變疾病病程〔1〕，且治療和護理費用昂貴。找尋防治AD的有效方法迫在眉睫，對AD研究的側重點也開始轉向早期診斷和早期干預〔2〕。本研究觀察艾灸預處理對AD模型大鼠海馬區腦源性神經營養因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶(Trk)B含量的影響，探討艾灸防治AD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠(15月齡)50只，體重350～480 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供(許可證號:SCXK(鄂)2004－0007)。所有大鼠提前1 w運到實驗室適應性喂養，安靜清潔環境下正常飲食飲水。然后進行Y型水迷宮篩選，淘汰反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠，將合格大鼠按隨機數字表法分為4組，正常組、假手術組、模型組、預艾灸組，每組10只。

1.2 主要試劑及儀器 Aβ25～35(美國 Sigma公司)，兔抗鼠BDNF多克隆一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗鼠TrkB多克隆一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化SP－9001試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，DW－5腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)，臺式牙鉆機(成都康發醫療器械有限公司);ES－2100S電子天平(長沙湘平科技發展有限公司)，Sartorius分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，輪轉式石蠟切片機(德國Leitz公司)，PHY－Ⅲ病理組織漂洪處理儀(常州中威電子儀器廠)，BMJ－Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺(常州中威電子儀器廠)，BX50光學顯微鏡(日本OLMPUS公司)，HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(同濟醫科大學千屏影像公司)。

1.3 AD模型制作

1.3.1 Aβ25～35孵育 用無菌生理鹽水將 Aβ25～35稀釋成5 μg/μl，密封后置于37℃培養箱中孵育1 w，使其變為聚集狀態的 Aβ25～35。

1.3.2 造模方法 在腦立體定位儀下，大鼠雙側海馬一次性注射聚集態Aβ25～35制作AD模型〔3〕。大鼠給予10%水合氯醛(35 mg/100 g體重)腹腔注射麻醉后，將鼠頭固定于腦立體定位儀上保持前后囟在同一水平，剪開頭皮，暴露前囟，定位海馬區〔4〕(前囟后3.5 mm，中線旁開2.0 mm，硬腦膜下2.7 mm)，臺式牙鉆機鉆一小孔 (直徑1 mm)，垂直插入微量進樣器，將Aβ25～35聚集液緩慢注入，左右側各注射1 μl(5 μg/μl)，注射速度 0.2 μl/min，注射完畢后留針 5 min，使Aβ25～35充分浸潤局部組織，按1.0 mm/min速度緩慢拔針。完成后馬上縫合頭皮，術后每天肌肉注射青霉素10萬U/只，連續5 d。

1.4 各組處理方法 ①預艾灸組，對正常大鼠先施于艾灸刺激。艾灸方法:采用自制的直徑約8 mm艾條，參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》〔5〕，于正常大鼠“百會”(頂骨正中)、“腎俞”(第2腰椎下兩旁)、“足三里”(膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處)穴上方2～3 cm處懸灸(“腎俞”、“足三里”左右隔日交替使用)，每穴持續5 min，每日1次，6 d為1療程，療程間休息1 d，共3個療程。施灸結束當日即開始給大鼠雙側海馬區注射Aβ25～35建立AD模型，造模后次日繼續艾灸治療1療程。②模型組:正常喂養3 w后，按前述方法造模。造模后喂養1 w，檢測指標。③假手術組:雙側海馬區注射等量生理鹽水，余同模型組。④正常組:同步喂養，不做任何處理。

1.5 組織取材及處理 用10%水合氯醛 (35 mg/100 g體重)腹腔注射麻醉大鼠，剖開腹腔和胸腔，暴露心臟。用灌胃針從心尖部位插進左心室，穿入主動脈，然后將右心耳剪口以使血液和灌注液流出。先用生理鹽水快速灌注，沖洗至右心耳流出液體變為無色及內臟顏色變成淺白，再用4%多聚甲醛灌注固定至動物全身僵硬。斷頭快速取腦，在視交叉平面前后4 mm處將腦冠狀切開，留取中間部分置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定過夜，常規石蠟包埋，連續切片，片厚4 μm。

1.6 指標檢測 免疫組化SP法檢測BDNF、TrkB:石蠟切片，常規脫蠟至水;高溫下EDTA液抗原修復;3%過氧化氫液37℃下孵育10 min;蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min;正常山羊血清室溫下孵育10 min;一抗4℃孵育過夜;PBS沖洗，3 min×3次;生物素標記的二抗37℃下孵育10 min;PBS沖洗，3 min×3次;辣根酶標記鏈酶卵白素工作液37℃下孵育10 min;PBS沖洗，3 min×3次;DAB顯色，自來水沖洗終止反應;蘇木精復染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗做陰性對照，其他步驟相同。

1.7 圖像分析及統計學處理 OLMPUS BX50光學顯微鏡下觀察海馬CA1區并攝像。用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文分析系統測定免疫反應陽性產物的平均灰度值，每組每張切片海馬CA1區隨機選取4個視野，取平均值。數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，運用SPSS13.0軟件統計。

2 結果

免疫組化切片以細胞胞質內呈現棕黃色為陽性。平均灰度值與免疫陽性產物含量成反比，灰度值低，說明透光度低，染色強度高。與正常組及假手術組比較，模型組大鼠海馬CA1區BDNF及TrkB的表達明顯下降，表現為陽性神經元平均灰度值明顯上升 (P＜0.01);與模型組比較，預艾灸組大鼠海馬CA1區BDNF及TrkB的表達明顯增加，表現為陽性神經元平均灰度值明顯降低 (P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠海馬CA1區BDNF及其受體TrkB陽性神經元平均灰度值(±s)

表1 各組大鼠海馬CA1區BDNF及其受體TrkB陽性神經元平均灰度值(±s)

與正常組及假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 n BDNF TrkB正常組10 133.01±17.21 125.83±16.12假手術組 10 135.68±15.13 128.74±18.35模型組 10 178.30±11.321) 167.25±12.861)預艾灸組 10 143.12±10.372) 136.32±10.542)

3 討論

中醫學認為，AD的病位在腦，其發病與五臟功能密切相關，其中與腎、肝、心、脾四臟關系最為密切。腎精虧虛為AD的基本病機，痰濁瘀血既是AD患者體內的病理產物，又是AD的致病因素，其病理性質為本虛標實。腎精虛衰，髓海空虛為病之本。血瘀、痰濁內阻，濁陰不降，上蒙清竅為病之標〔7，8〕。依據AD“本虛標實”的病理性質及其病因，病機，病位和臨床癥狀等特點，我們制定了“益腎精、健脾胃、補腦髓”的治療法則，選取“百會”、“腎俞”、“足三里”穴艾灸進行防治。百會位居頭之巔頂，又名三陽五會，是督脈與足太陽、手少陽、足少陽、足厥陰等經脈交會處，是治療腦病的首選穴位，具有通調督脈氣血，補腦益智之功。腎俞位于背部，是膀胱經之腧穴、腎之背俞穴，可補益腎精，且其所屬經脈“入絡腦”。足三里是足陽明胃經的合穴，胃腑下合穴，可調理脾胃，助脾胃運化水濕，蠲化痰濁;又可補益氣血，填精益髓，使髓海充足，神清竅利。百會、腎俞、足三里三穴同用，可使腦髓得氣血榮養而改善健忘、癡呆之癥。

BDNF是NTFs家族重要的成員之一，廣泛分布于中樞神經系統，能調節神經元的發生、發育和存活，維持成熟神經元的功能〔8〕，在改善認知功能方面也起著重要作用〔9〕。酪氨酸激酶(Trk)A，TrkB和TrkC是NTFs的受體，其中，TrkB為BDNF的特異性受體〔10〕，具有酪氨酸激酶活性。BDNF與TrkB結合可調節神經營養信號。研究發現，BDNF的表達與學習和記憶過程關系密切。動物經水迷宮學習訓練后，腦內BDNF mRNA表達增加〔11〕，而BDNF缺乏的動物空間學習和記憶則出現明顯障礙〔12〕。

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5 華興邦，李辭榮，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制〔J〕.實驗動物與動物實驗，1991;19(1):1－5.

6 朱建華.老年性癡呆〔J〕.江蘇中醫藥雜志，2004;25(10):12－4.

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8 Mctigue DM，Horner PJ，Stokes BT，et al.Neurotrophic－3 and brain－derived neurotrophic factor induce oligodendrocyte proliferation and myelination of regenerating axons in the contused adult rat spinal cord〔J〕.J Neurosci，1998;18(14):5354－65.

9 Mu JS，Li WP，Yao ZB，et al.Deprivation of endogenous brain derived neurotrophic factor results in impairment of spatial learning and memory in adult rats〔J〕.Brain Res，1999;835(2):259－65.

10 Merlio JP，Ernfors P，Kokaia Z，et al.Increased production of the TrkB protein tyrosine kinase receptor after brain insults〔J〕.Neuron，1993;10(2):151－64.

11 Kesslak JP，So V，Choi J，et al.Learning upregulates brain－derived neurotrophic factor messenger ribonucleic acid:a mechanism to facilitate encoding and circuit maintenance〔J〕.Behav Neurosci，1998;112(4):1012－9.

12 Linnarsson S，Bjorklund A，Ernfors P.Learning deficit in BDNF mutant mice〔J〕.Eur J Neurosci，1997;9(12):2581－7.