沙蠶金屬蛋白酶體外抗凝血與溶栓作用

鄧志會 孫東升 李 波 肖 微 (齊齊哈爾醫學院病理生理學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目前，溶栓治療被認為是治療血栓性疾病最為有效的方法，極大地降低了血栓性疾病的病死率和致殘率〔1〕;但這些藥物也存在一些缺點，如出血、過敏反應及價格昂貴等〔2〕。因此，尋找和開發新型溶栓劑仍是治療血栓性疾病的重要內容。生物體是溶栓劑的主要來源〔3～5〕。沙蠶是一種海洋無脊椎動物，體內含有多種纖維蛋白水解酶〔6，7〕。沙蠶金屬蛋白酶(NVMP)是從海洋生物沙蠶體內分離純化的一種新型的具有纖溶活性的金屬蛋白酶，是一種分子量為28～32 kD的單鏈蛋白，等電聚焦電泳顯示其等電點為8.0〔8〕。本研究進一步探討其在體外的溶栓和抗凝血作用及相關機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 家兔購于我校動物室;NVMP為本實驗室前期制備的凍干品;牛血凝血酶和牛血纖維蛋白原購于中國藥品生物制品研究所;低分子量蛋白Marker購于Amersham Biosciences公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 抗凝血實驗 家兔心臟取血。取4支滅菌小試管，分別加1 ml 0.9%NaCl(用 0.02 mol/L pH7.4 PBS 配制)，0.5、0.25、0.125 mg/ml的 NVMP(0.9%NaCl配制);然后每管加1 ml的血液，輕輕振蕩、混勻，置37℃恒溫水浴，定時觀察血液的凝固狀態。

1.3 血栓溶解率實驗 家兔心臟取血，體外在培養皿內自然凝固，制成實驗性血栓。將血栓切割成大致相等的4份，分別稱重后依次加入4支滅菌試管內，再依次加入0.9%NaCl 1 ml，NVMP 5.0 mg/ml和 2 mg/ml(0.9%NaCl 配制)。置37℃恒溫水浴，2 h后取出所有試管，小心取出血栓，并用濾紙條輕輕吸干血栓表面水分后，依次稱重。重復做三次，計算血栓溶解率。溶解率=(W－G)/W×100%，W:實驗前血栓重量，G:實驗后血栓重量。

1.4 纖維蛋白原水解活性分析 500 μg牛血纖維蛋白原和0.5 μg 純 化 的 NVMP 溶 解 在 500 μl 20 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)緩沖液中，37℃恒溫孵育，在不同的時間間隔(0、1、3、5、10、30、60、120 min)取出一部分進行 SDS-PAGE 電泳分析(5%濃縮膠、10%分離膠)，觀察NVMP水解纖維蛋白原各亞基的先后順序。

1.5 纖維蛋白溶解方式 采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測NVMP溶解纖維蛋白的方式。瓊脂糖-纖維蛋白平板的鋪板方法參照蚓激酶的國家藥品標準〔9〕:鋪兩個瓊脂糖-纖維蛋白平板:一個為加熱平板，在制作過程中不加纖溶酶原，制備好的纖維蛋白平板放在恒溫干燥箱中80℃加熱30 min，滅活殘存在纖維蛋白原和凝血酶中的纖溶酶原和其他的促纖溶因子;另一個為不加熱平板，在制作過程中加入10 mU/L的纖溶酶原200 μl不加熱。每個平板打孔，加入10 μl的NVMP，37℃恒溫箱中孵育過夜，測量各加樣孔產生的溶圈直徑。

2 結果

2.1 NVMP的抗凝血作用 加入0.9%NaCl的陰性對照組在37℃恒溫孵育10 min后就已經凝固;加入0.125 mg/ml和0.25 mg/ml NVMP實驗組在37℃孵育10 min時血液未凝固，在30 min時分別形成少量的小血凝塊，在1 h后血凝塊完全溶解，血液呈溶解狀態;而加入0.5 mg/ml NVMP的實驗組血液一直處于未凝固狀態。表明，NVMP具有明顯的抗凝血作用。

2.2 NVMP溶解血栓的效果 以兔新鮮血栓為材料，不同濃度的NVMP(0.125，0.25和0.5 mg/ml)在37℃恒溫條件下，作用2 h后血栓溶解率分別為(67.5±4.7)%，(79.7±6.7)%和(85.2±8.2)%;而0.9%NaCl對照組血栓溶解率僅為(12.3±1.9)%。結果表明，NVMP具有較強的血栓溶解作用，在較低濃度下(0.125 mg/ml)對血栓仍具有較好的溶栓效果，且隨NVMP濃度的增加溶解血栓的能力也逐漸增強。

2.3 NVMP水解纖維蛋白原的活性分析 將NVMP與牛血纖維蛋白原一起在37°C條件下作用，在不同的時間取出一部分進行SDS-PAGE電泳分析，結果見圖1。NVMP最先水解牛血纖維蛋白原的Aα鏈，在1 min內將其完全水解;然后牛血纖維蛋白原的Bβ鏈逐漸被水解，在作用30 min內水解完全;γ鏈是最后被水解的，在作用120 min時被完全水解。說明NVMP具有降纖作用，而且水解纖維蛋白原各亞基的速度由快到慢的順序為Aα鏈、Bβ鏈、γ鏈。

圖1 SDS-PAGE電泳分析NVMP的纖維蛋白原水解活性

2.4 NVMP溶解纖維蛋白的方式 使用加熱和未加熱兩個瓊脂糖-纖維蛋白平板，觀察NVMP對纖維蛋白的水解作用，結果見圖2。在加熱和不加熱的纖維蛋白平板上，NVMP均產生明顯的溶圈，說明蛋白酶可以在沒有纖溶酶原的條件下，直接水解纖維蛋白;同時，富含纖溶酶原的不加熱平板上，蛋白酶產生的溶圈直徑略大于不含纖溶酶原的加熱平板，說明該蛋白酶也具有一定的激酶活性，可以通過激活纖溶酶原轉變成纖溶酶的方式，間接水解纖維蛋白，這種具有激酶和纖溶酶的雙重特性與蚓激酶相似，表明其具有較強的溶栓活性。

3 討論

纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉變成纖維蛋白，直接參與凝血過程;纖維蛋白原還可介導血小板聚集反應。本實驗發現NVMP能夠快速地水解纖維蛋白原，具有降纖作用，進而影響血液凝固過程，因此在體外表現出良好的抗凝血和抑制血栓形成的作用。NVMP的這種降纖作用是非常重要的，應用于臨床時，它能夠降低全血和血漿黏度，增加血流速度，改善微循環，從而抑制血栓的形成和進一步增大，預期對血栓性疾病會具有較好的臨床療效。本實驗還發現，NVMP具有直接水解纖維蛋白的活性，是一種纖維蛋白溶解酶;同時還具有激活纖溶酶原轉變成纖溶酶的激酶活性，因此在體外會表現出較強的纖維蛋白溶解活性，能夠快速地溶解血栓。

圖2 NVMP的纖維蛋白水解活性分析

對于血栓性疾病，早期(6～12 h內)的溶栓和降纖是治療的重要手段。本研究表明，NVMP在體外具有明顯抗凝血、抑制血栓形成和溶解血栓的作用，且隨劑量增加作用有所增強。因此，有望將其開發成為新型的溶栓藥物。

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