乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表達及其意義

萬彥彬，李觀強，李朝輝

(深圳市龍崗區人民醫院檢驗科，廣東 深圳 517182)

乙型肝炎是臨床常見疾病，患者發病過程中除了肝細胞中相關蛋白異常表達，還可引起血清中相關蛋白的表達增加。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)至今已發現10余個[1]，它通過識別病原相關的分子模式及某些內源性配體，引發信號轉導并導致炎癥介質的釋放，在天然防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統[2]。目前研究中多為檢測外周血單個核細胞中TLR的表達水平，尚未見TLR為分泌型表達的相關報道，尤其是在乙型肝炎病變中。本實驗通過酶聯免疫吸附實驗檢測血清中TLR2和TLR4的表達，探討其表達意義及相互關系，為探討腫瘤的生物學行為提供必要的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月至2011年12月在我院確診為乙型肝炎患者的血清標本。共130例作為觀察組，納入標準均符合慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版。本組患者中慢性乙型肝炎46例，乙型肝炎肝硬化57例，重型肝炎27例。本組中男性患者70例，女性患者60例。年齡24～69歲，平均(49.89±8.55)歲。排除標準：①近三個月有嚴重感染的患者；②伴有其他嚴重內臟器官疾病的患者；③有風濕病史的患者；④伴有惡性腫瘤的患者。收集同期體驗證實為健康的成人血清60例作為對照組，其中男性40例，女性20例，年齡25～68歲。觀察組與對照組在一般臨床資料的比較中，無明顯差別，可以進行臨床比較。

1.2 TLR2和TLR4表達的檢測 TLR2和TLR4 ELISA試劑盒均購自上海研吉生物科技有限公司。觀察組患者在確診為乙型肝炎后次日早晨空腹抽取靜脈血5 ml，經枸椽酸鈉抗凝后，以3 000 r/min離心10 min，留取血漿，于-20℃冰箱中凍存備用；對照組采血方法同上。本組均在取血后一個月內檢測。應用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清中TLR2和TLR4的表達。檢測均由同一檢驗師操作，步驟嚴格按照操作說明進行，嚴格質控。

1.3 統計學方法 應用SAS6.12統計軟件進行統計分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較應用方差分析，同時應用SNK法進行兩兩比較，而相關分析應用線性相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組與對照組血清中TLR2和TLR4表達的比較 TLR2和TLR4在觀察組血清中的表達量明顯高于對照組，見表1。

表1 兩組血清中TLR2和TLR4表達的比較(ng/L，±s)

表1 兩組血清中TLR2和TLR4表達的比較(ng/L，±s)

注：與對照組比較，**P<0.05。

*

2.2 乙型肝炎不同病變程度患者血清中TLR2和TLR4表達的比較 觀察組中TLR2和TLR4在乙肝患者不同分型的比較中差異均有統計學意義，即TLR2和TLR4在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、重型肝炎中的表達依次升高，見表2。

表2 觀察組中TLR2和TLR4在不同分組患者的表達(ng/L，±s)

表2 觀察組中TLR2和TLR4在不同分組患者的表達(ng/L，±s)

注：經方差分析，組間比較應用SNK法進行兩兩比較。*組間比較差異均有統計學意義。

組別慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化重型肝炎27例數46 TLR2 74.12±11.94 t P t P 8.68 0.0019**TLR4 78.64±17.24 7.32 0.0019**57 83.43±26.35 99.67±28.53 112.33±25.53 118.60±36.46*

2.3 乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4表達的關系 經相關分析，觀察組患者血清中TLR2和TLR4的表達呈正相關(P=0.021 4，r=0.39)。

3 討論

TLRs作為具有免疫調節作用的物質，能有效的識別受體，包括對病原和病毒的特異性的位點的識別。也有研究認為TLRs可以形成機體免疫調節的重要防線，并通過信號轉導，調節內環境中細胞合成物質的釋放，而在此過程中TLR2主要針對G+桿菌、螺旋體和支原體等[3]。而TLR4作為內毒素的特異性受體，通過識別血清內毒素，與LPS/LBP/CD14結合，可以激活IRAK家族，可以成功誘導核因子的活化，進而發揮生物學作用[4]。TLR-4還可以激活靶基因轉錄，釋放一系列細胞因子，引起肝組織細胞的廣泛損傷。當機體感染肝炎病毒后，在機體清除病毒、病毒感染的慢性化及重癥肝損傷的各個環節中，TLR2和TLR4的高表達均起到了重要的促進作用[5]，還有研究認為TLR-2的作用可能通過與NF-κB作用實現的[6]。

本實驗對收集的血清標本應用酶聯免疫吸附實驗進行檢測，結果顯示乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表達明顯增高，提示TLR2和TLR4在乙型肝炎發生中可能起重要促進作用。在乙型肝炎不同類型分組的比較中，我們能明顯觀察到慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及重型肝炎的表達依次增強，提示TLR2和TLR4在乙型肝炎病變發展中起重要作用，也提示臨床中聯合檢測TLR2和TLR4可能是初步判斷病情嚴重程度的重要指標。相關分析顯示乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表達呈正相關，提示二者具有明顯協同作用，并參與肝炎的發展過程。而慢性肝炎患者發病時過程中，胃腸道的黏膜出現明顯的病變，引起靜脈內淤血，而且肝細胞出現變性和壞死，引起蛋白產生減少，機體的免疫力低下，竇內皮細胞清除功能下降，因此對毒素的吞噬和清除功能降低，伴發內毒素血癥。還有學者認為肝硬化時內毒素的表達升高，引起TLR4異常表達，對疾病進展中發揮了重要作用[7]。TLR2信號途徑可能起較為重要的作用，其原因是TLR2可對病原體直接產生防御反應，從而介導天然免疫反應，并同時誘發機體繼發免疫反應。鑒于乙肝患者的病情越重，TLR2的表達強度越高，也間接說明TLR2參與了乙型肝炎發病過程中的免疫損傷[8]。

總之，乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4高表達，二者可能具有協同作用。聯合檢測血清中TLR2和TLR4可能對判斷病情的嚴重程度有重要價值。

[1]Round JL,Lee SM,Li J,et al.The Toll-like receptor 2 pathway establishes colonization by a commensal of the human microbiota[J].Science,2011,332(6032):974-977.

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[3]陳 煜,時紅波,張 帆,等.慢性重型肝炎患者外周血單個核細胞中TLR2、TLR3和TLR9的mRNA表達[J].肝臟,2010,15(4):244-246.

[4]張進祥,吳河水,王 慧,等.小鼠肝缺血再灌注后Toll樣受體2在缺血肝組織中的激活及其意義[J].中國普通外科雜志,2005,14(2):114-117.

[5]Zhang Y,Lian JQ,Huang CX,et al.Overexpression of Toll-like receptor 2/4 on monocytes modulates the activities of CD4(+)CD25(+)regulatory T cells in chronic hepatitis B virus infection[J].Virology,2010,397(1):34-42.

[6]Toubiana J,Rossi AL,Grimaldi D,et al.IMPDHII Protein Inhibits Toll-like Receptor 2-mediated Activation of NF-{kappa}B[J].J Biol Chem,2011,286(26):23319-23333.

[7]Chen Z,Cheng Y,Xu Y,et al.Expression profiles and function of Toll-like receptors 2 and 4 in peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis B patients[J].Clin Immunol,2008,128(3):400-408.

[8]郭云蔚,尉秀清,李永偉,等.慢性乙型肝炎患者肝組織中Toll樣受體2的表達及其臨床意義[J].新醫學,2007,38(2):79-81.