不同劑量弗氏完全佐劑對類風濕關節炎模型大鼠復制的影響

彭傳玉 羅 磊 胡 玲 宋小鴿 唐照亮 吳子建 蔡榮林 郝 峰 胡吳斌

（安徽中醫學院，安徽 合肥 230038）

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis, RA）是以慢性多關節炎癥為主要表現的全身性自身免疫性疾病[1]，我國患病率約為0.32%～0.36%[2]，是造成人類勞動力喪失和致殘的主要因素之一[3]。建立一個實用而可靠的動物模型是深入研究RA發病機制和評價藥物療效的重要手段。目前，RA的動物模型復制有多種方法[4,5]，其中弗氏完全佐劑（Eph's complete adjuvant，FCA）誘導的大鼠佐劑性關節炎（Adjuvant Arthritis，AA）最為經典、最為常用。但是關于模型復制中弗氏完全佐劑使用的劑量與模型復制之間的關系的報道較少。本實驗目的在于探討RA模型復制中弗氏完全佐劑的最佳注射量，以期提供較為準確、全面、持久的模型復制方法。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選擇清潔級雄性Wistar大鼠，體質量180～200g，月齡3～4個月，80只，由南京醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2008-0004。實驗前將大鼠放置鼠籠常規適應性喂養1周。實驗前根據第四版《衛生統計學》隨機編號表將動物隨機分為 4組，分別為正常組、0.1mL模型復制組（0.1組）、0.15mL模型復制組（0.15組），0.2mL模型復制組（0.2組）。并用苦味酸給各組的大鼠染色以標記編號。大鼠自由飲食，自然光照，并定期清潔、消毒。

1.2 材料與儀器

弗氏完全佐劑：美國SIGMA公司，10mL，068K8761；電子稱：蘇州蘇靈儀表有限公司，ACS-6；X儀器：X射線機Kadak Directview（DR7500）。

1.3 模型復制方法

實驗采用“病證結合”復合佐劑性關節炎模型復制方法[6]，即風、寒、濕環境因素+弗氏完全佐劑。實驗用大鼠適應性喂養1周后，除正常組外，其余各組大鼠置于風、寒、濕環境喂養20d。第21天，于大鼠右后足跖部經酒精消毒后，不同組別的每只大鼠分別注入0.1mL、0.15mL、0.2mL弗氏完全佐劑。可見24h后各模型組大鼠右后足跖部明顯腫脹，48h后可見繼發性炎性反應，表現為前肢或對側肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結節出現，示造模成功。

1.4 觀察和檢測指標

①體質量：各組大鼠分別于模型復制前、模型復制成功后第1天、模型復制成功后第10天，使用電子稱于同一時間、地點稱量大鼠體質量并做記錄。②跖圍：各組大鼠分別于模型復制前、模型復制成功后第1天、模型復制成功后第10天，于同一時間、地點測量大鼠跖圍。跖圍測量方法：在同一時間用手術線環繞大鼠右下足跖部相應骨性標志處測量其圍長。③大鼠關節X線觀察：模型復制成功后第10天，各組大鼠分別置于X線下觀察其關節骨性變化。由多年經驗放射科醫師指導完成。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 實驗前后大鼠體質量的比較

模型復制前，各模型組大鼠與正常組相比無統計學意義（P＞0.05）。模型復制成功后第1天，各模型組大鼠與正常組相比，體質量均有所減輕，具有明顯的差異性（P＜0.05）。模型復制成功后第10天，0.1mL模型復制組體質量有所恢復，0.15mL模型復制組和0.2mL模型復制組體質量逐漸減輕，0.1mL模型復制組、0.15mL模型復制組、0.2mL模型復制組與正常組比較，有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 FCA不同注射量對實驗大鼠體質量的影響（g）

2.2 實驗前后大鼠趾圍的比較

模型復制前，各模型組大鼠與正常組比較，無統計學意義（P＞0.05）；模型復制成功后1d，各模型組大鼠與正常組比較，趾圍均有增加，有顯著性差異（P＜0.05）；0.1mL模型復制組、0.15ml模型復制組、0.2mL模型復制組之間無統計學意義（P＞0.05）.示造模成功；模型復制成功后第10天，0.1mL模型復制組腫脹有所減輕，0.15mL模型復制組和0.2mL模型復制組腫脹持續性加重，0.15組、0.2組與正常組、0.1組比較有統計學意義（P＜0.05）；0.1組與與正常組無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 FCA不同注射量對實驗大鼠趾圍的影響（cm）

2.3 FCA不同注射量的RA大鼠X線比較

注射量為0.1mL的RA大鼠的X線表現為軟組織的輕微腫脹，致炎不完全，后期繼發性全身炎癥反應不明顯，而且在后期慢性炎癥階段出現自愈趨勢。注射量為0.15mL的RA大鼠出現關節周圍的軟組織明顯腫脹，關節破壞明顯，隨著病情的發展出現全身性繼發反應，主要表現為關節面愈趨模糊，近關節處骨質疏松，骨質侵襲，尤其關節處出現結節增生，且不斷增大，僵硬。注射量為0.2mL的RA大鼠的X 線表現為關節軟組織明顯腫脹，骨質嚴重侵襲，關節軟骨破壞嚴重，與臨床類風濕關節炎患者關節軟骨破壞相差較大。見圖1～4。

圖1 正常組大鼠X線表現右后肢踝關節周圍軟組織未見腫脹，關節間隙正常，未見骨性改變，關節面密度均勻

圖20 .1mL模型復制組X線表現右后肢踝關節周圍軟組織腫脹存在，關節間隙基本正常，未見骨性改變，關節面密度稍低且不均勻，有自愈現象

圖30 .15mL模型復制組X線表現右后肢踝關節周圍軟組織腫脹明顯，關節間隙變窄，軟骨破壞，關節面模糊毛糙，關節關系正常，與臨床類風濕關節炎關節軟骨改變較為接近

圖40 .2mL模型復制組X線表現右后肢踝關節周圍軟組織病損，顯像密度不均勻，可見踝關節骨折，骨質疏松與關節面受損嚴重，與臨床類風濕關節炎患者關節軟骨改變相差較遠

3 討 論

佐劑性關節炎動物模型是細菌學家Freund于20世紀50年代創立，又稱弗氏佐劑關節炎，是研究免疫性動物模型的基本方法[7,8]，不同的弗氏佐劑注射量影響造模的成功率、實驗的進程及實驗結果的可靠性。

本實驗分別從局部病變、全身癥狀、骨質變化等方面探討了RA模型復制中不同弗氏佐劑注射量的對模型復制的影響，以期為RA的實驗研究中提供較好的模型復制方法，為臨床觀察提供較為準確的實驗依據。

本實驗研究發現，在造模成功后第1天，模型組大鼠與正常組比較有統計學意義，是由于大鼠機體機能受到抑制，進食飲水量減少導致所成。但是在造模成功后第10天，可見0.1mL模型組大鼠體質量有所回升，0.15mL模型復制組和0.2mL模型復制組大鼠體質量始終保持下降趨勢，0.2mL模型復制組大鼠體質量下降較為明顯，但模型組大鼠均與正常組有統計學意義。就跖圍而言，在造模成功后第1天，與正常組大鼠比較，各模型組大鼠出現跖關節明顯紅腫，表現為早期的炎性反應，在造模成功后第10天，0.1mL模型復制組大鼠腫脹有所減輕，0.15mL模型復制組和0.2mL模型復制組關節腫脹呈進行性加重趨勢，大鼠行動不便。0.2mL模型復制組跖圍腫脹最為明顯，加重趨勢比較嚴重。

0.1mL模型復制組大鼠X線造模后與造模前相比，軟組織輕微腫脹，關節破壞不明顯。0.15mL模型復制組的RA大鼠足趾的軟組織腫脹明顯，關節間隙變窄，邊緣性骨質破壞，關節變形，且尾部關節可見部分風濕結節。0.2mL模型復制組的RA大鼠足趾腫脹明顯，骨質嚴重侵蝕，關節破壞明顯，可見粉碎性骨性改變。

綜上所述，注射量為0.15mL的RA大鼠在關節的局部出現病變如紅腫、皮溫升高、關節腫脹、變形、X線改變等較為接近人類類風濕關節炎的改變，同時其進食飲水量的減少導致體質量的下降、精神萎靡等全身癥狀，與類風濕關節炎患者癥狀較為相似。另一方面，筆者認為，臨床上類風濕關節炎患者大部分處于慢性進行性骨性改變期，建立一個能夠持久的模型復制方法是觀察類風濕關節炎的關鍵所在。通過本實驗研究發現0.15mL弗氏完全佐劑注射量在其局部癥狀、骨質的X線變化較為貼近臨床患者的局部病理變化，可能是RA模型復制中的最佳注射劑量。

[1]劉瓊,王晨瑤,方劍橋.類風濕性關節炎動物模型的研究進展[J].醫學綜述,2006,3(12):5.

[2]陸再英,鐘南山.內科學[M].7版.北京:人民衛生出版社,2008 :848.

[3]石磊,李小峰,張莉蕓,等.類風濕關節炎動物模型的研究進展[J].中國藥物與臨床,2009,9 (3):215.

[4]Klareskog L,McDevit H.Rheumatoid arthritis and it,s animal model:the role of TNF-a and the possible abence of Specific immune reactions[J].Curr Opin Immunol,1999,11(6):657.

[5]Joe B,Wilder RL.Animal modals of rheumatoid arthritis[J].Mol Med Today,1999,5(8):367.

[6]Hu L,Lars DH,Song XG,et al.Effect of Moxibustion on IL-1β and IL-2 in rat Models of Rheumatoid Arthritis[J].J Acupunct Tuina Sci,2010,8(3):149-153.

[7]Jacobson PB,Borgan SJ,Wilcox DM,et al .A new spin on an oldmodel : In vivo evaluation of disease progression by magnetic resonance imaging with respect to standard inflammatory parametersand histopathology in the adjuvant arthritic rat[J].A rthritis Rheum,1999,42(10):2060-2073

[8]林紅,賀永懷,黎燕,等.Ⅱ型膠原蛋白與弗氏完全佐劑大鼠關節炎模型的建立和比較[J].中國實驗動物學報,1999,7(1):1-6.