SEA對人結腸癌SW480細胞周期進程及凋亡的影響

姚路明 (長春前進醫(yī)院，吉林 長春 130062)

大腸癌是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，在我國近幾年發(fā)病率明顯上升〔1〕。隨著生物科學及醫(yī)學水平的提高，腫瘤生物治療取得了迅速發(fā)展，是繼手術、化療、放療后又一重要的治療手段。生物治療應用細胞生物學和分子生物學手段對機體免疫系統(tǒng)或腫瘤生長進行調控，從而抑制腫瘤生長〔2〕。本研究觀察超抗原SEA對SW480細胞增殖抑制率，旨在為大腸癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 SW480細胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，SEA由軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所提供。噻唑藍(MTT)試劑、RPMI1640培養(yǎng)基為美國Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 取指數(shù)生長期的SW480細胞，調細胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內100 μl/孔，當細胞生長達到80%匯合時，每孔內分別加入不同濃度的SEA溶液0、20、40、80 ng/ml，每個濃度 10 復孔，靜止培養(yǎng) 24 h，于結束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后加入二甲基亞砜150 μl/孔，振蕩5 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標儀570 nm波長處測量各孔吸光度A值，按下列公式計算SW480細胞增殖抑制率。SW480細胞增殖抑制率=(1－加藥孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100% 。

1.2.2 流式細胞術 細胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為50 ml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)后經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞PBS洗二次，70%冷乙醇固定，4℃內保存，上機前過40目尼龍網(wǎng)，調細胞數(shù)為1×106/ml，PI染色，流式細胞儀檢測，結果以Modifi 2.0軟件分析。

1.2.3 透射電子顯微鏡 細胞培養(yǎng)及分組同1.2.2，培養(yǎng)結束后分別收集不同濃度SEA作用的SW480細胞，離心棄上清，沉淀細胞經(jīng)2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛－鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS11.0軟件分析，組間比較采用t檢驗、F檢驗。

2 結果

2.1 MTT結果 不同濃度的SEA對SW480細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對照組相比差異顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 不同濃度的SEA對SW480細胞增殖抑制率(±s)

表1 不同濃度的SEA對SW480細胞增殖抑制率(±s)

組別 A值 抑制率 P值1.52±0.12 － －20 ng/ml組 1.24±0.14 18.5% ＜0.01 40 ng/ml組 0.95±0.17 37.6% ＜0.01 80 ng/ml組0 ng/ml組0.83±0.24 41.5% ＜0.01

2.2 流式細胞術結果 不同濃度的SEA對SW480細胞增殖周期均有影響，G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，且細胞凋亡率升高。見表2。

2.3 透視電子顯微鏡結果 圖1可見，20 ng/mlSEA組SW480細胞腫脹，有空泡形成;40ng/mlSEA組SW480細胞脆質呈條索狀，線粒體腫脹;80 ng/ml SEA組SW480細胞核染色質趨邊、凝集，可見凋亡小體。

表2 不同濃度的SEA對SW480細胞周期進程影響(±s，%)

表2 不同濃度的SEA對SW480細胞周期進程影響(±s，%)

32.5±2.1 63.2±3.6 4.3±1.9 1.6 20 ng/ml組 44.6±3.8 39.8±4.7 15.6±2.6 11.2 40 ng/ml組 54.2±4.4 26.5±3.3 19.3±2.1 17.8 80 ng/ml組凋亡率0 ng/ml組組別 G0/G1 S G2/M 59.6±4.2 18.2±3.1 22.3±3.7 20.4

圖1 透視電子顯微鏡觀察各組SW480(×5 000)

3 討論

SEA是一組對熱穩(wěn)定的可溶性蛋白質，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常見病因〔3〕。SEA屬于外源性超抗原物質，不需加工直接與MHCⅡ類分子結合形成配體，通過該配體抑制細胞增殖，同時作為超抗原物質可刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生淋巴因子，參與機體免疫應答反應。

本研究中MTT結果顯示不同濃度的SEA對SW480細胞的增殖抑制具有明顯的劑量依賴性，流式細胞儀結果顯示，不同濃度的SEA對SW480細胞周期進程均有影響。SEA具有直接的細胞毒效應，能夠抑制G1期細胞向S期細胞轉化進程，使G1期細胞堆積，不能進入S期，停止于G1期，造成S期細胞減少，從而使G2/M期細胞相對增多，而G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反映〔4〕。G1期細胞又稱細胞復制前期，G1期制造和產(chǎn)生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白體，同時G1期也是多種化學藥物作用的敏感點〔5〕。因此，抑制G1期細胞的進程，從而使細胞增殖變緩，可達到抑制腫瘤增殖的目的〔6〕。

綜上所述，本研究應用SEA直接作用于SW480細胞，獲得較為滿意的結果。證明SEA具有直接的細胞毒作用，可用于腫瘤的局部治療。

1 高 巍，劉尚梅.結直腸神經(jīng)內分泌腫瘤的研究進展〔J〕.國際腫瘤學雜志，2011;38(9):693-6.

2 劉 娣，許曉群，王郡甫.IL-24的生物學特征及其抗腫瘤作用機制〔J〕.國際腫瘤學雜志，2010;37(9):657-61.

3 Thomas D，Chou S，Dauwalder O，et al.Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins〔J〕.Chem Immunol Allergy，2007;93:24-41.

4 Eillnger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss，2000;5(6):491-8.

5 Martin LG，Demers GW，Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papiloma Viras type/6 E7-expressing human cells in associated regulation of cyclin E〔J〕.J Virol，1998;72(2):975-85.

6 Jie KG，Jiang H，Sun L，et al.The pilot study of anti-tumor effects versus immunosuppression of Staphylococcal Enterotoxin C〔J〕.Cancer Biol T-her，2007;6(10):1584-91.