逍遙散提取液對乳腺癌細胞MCF-7細胞周期的影響

張 虹 季有波 (長春醫學高等專科學校，吉林 長春 3003)

中醫認為乳腺癌或癌前病變屬于“乳巖”、“乳癖”范疇，乃由情志不暢、肝郁氣滯、血瘀、脾氣消沮等所致。而逍遙散行氣疏肝，調暢神志，具有抗焦慮、抗抑郁作用，從而影響癌癥的發生發展〔1〕。本課題組在前期研究中證實了逍遙散提取液對乳腺癌細胞MCF-7有顯著的生長抑制作用〔2〕。本實驗進一步探討逍遙散提取液對細胞周期的影響，為古方新用及乳腺癌的防治進一步提供實驗依據。

1 材料與試劑

1.1 試劑 DMEM 培養基(Invitrogen)、RNase、PI購自 Sigma公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.2 藥物 逍遙散的藥物組成及用量為：柴胡、當歸、白術、茯苓、芍藥各30 g，炙甘草15 g，煨姜、薄荷各1 g，購自市售藥店，并經過嚴格鑒定。按上述組方和單品藥當歸取生藥，加蒸餾水回流提取3次，每次分別為60、30、30 min，濃縮藥液，再加入DMEM培養液稀釋，配成濃度為1 g/ml藥液，過濾除菌，4℃保存備用。

1.3 細胞培養 人乳腺癌細胞系(MCF-7)購自吉林省腫瘤研究所，置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、5%CO2空氣及飽和濕度條件下培養。以每5×104細胞/瓶接種，24 h換液1次并加入相應濃度的逍遙散提取液。

1.4 FCM檢測細胞檢測細胞周期 取對數生長期細胞用于實驗，隨機分5組：對照組、逍遙散提取液低劑量組(2 mg/ml)、中劑量組(5 mg/ml)、高劑量組(10 mg/ml)、當歸組(5 mg/ml)。按照常規方法用PI染色，流式細胞儀檢測細胞周期〔3〕。經低、中、高劑量的逍遙散提取液和當歸分別作用48 h，收集MCF-7細胞，用PBS沖洗兩次，70% 冷乙醇固定過夜。PBS沖洗2次，加RNase，37℃水浴30 min降解RNA;再用PBS洗2次后，加PI染液，4℃避光反應30 min，經PBS洗滌后上機檢測。用FACScan流式細胞儀Cellfit軟件收取細胞測定DNA含量的變化，每個樣品收集細胞數為1×104個。

1.5 統計學分析 所有數據均采用SAS統計軟件進行檢測，數據用s表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

經流式細胞儀檢測，不同劑量的逍遙散提取液和當歸提取液對乳腺癌細胞MCF-7作用48 h后，各周期細胞比例見表1。

表1 逍遙散提取液對乳腺癌細胞MCF-7細胞周期的影響( s ，%)

表1 逍遙散提取液對乳腺癌細胞MCF-7細胞周期的影響( s ，%)

與對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M逍遙散低劑量組 63.813±0.783 35.828±0.9551) 0.480±0.1231)中劑量組 55.615±1.4532) 28.258±3.7201) 0.207±0.1001)高劑量組 54.463±2.6962) 25.430±4.2461) 0.190±0.1471)對照組 64.763±2.202 36.238±1.110 0.597±0.076當歸組68.250±3.990 31.500±4.210 0.250±0.250

3 討論

細胞周期是指細胞從第一次分裂結束產生新細胞到第二次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期(M期)兩個階段。分裂間期是物質準備和積累階段，分裂期則是細胞增殖的實施過程。間期又分為休眠期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)，在此期間主要完成染色質中的DNA復制和相關蛋白質的合成。M期為細胞分裂期，在此期間進行細胞物質的平均分配，一個細胞經過分裂形成兩個新的細胞。

在細胞周期中，S期是細胞增殖的關鍵，其最主要的特征是DNA的合成，DNA分子的復制就是在這個時期進行的。通常只要DNA的合成一開始，細胞增殖活動就會進行下去，直到分裂成兩個子細胞。因此通過某種因素進行干擾、破壞或抑制DNA合成，就可以抑制癌細胞增殖，從而達到治療癌癥的目的。例如，放射線能破壞癌細胞DNA的結構與合成，治療某些腫瘤〔4〕;藥物秋水仙堿等則可阻止紡錘體的形成，從而抑制癌細胞的分裂〔5〕。

因為單味當歸可能有促進婦女乳腺癌細胞增生的作用〔6〕，因此本實驗采用當歸提取液組作對照。本實驗觀察結果表明，逍遙散提取液3個不同濃度組對乳腺癌細胞MCF-7作用48 h后，S期細胞比例降低，且隨著藥物濃度的增加，細胞比例降低更明顯。提示逍遙散提取液可通過阻斷乳腺癌細胞MCF-7 DNA合成的方式，抑制乳腺癌細胞體外增殖;而單味當歸亦無促進DNA合成作用。

1 吳在德.外科學〔M〕.第5版.北京：人民衛生出版社，2001：1.

2 王 迪，張 虹，付士波，等.逍遙散對乳腺癌細胞抑制作用實驗研究〔J〕.中醫藥學刊，2006;(4)：643-4.

3 蘇 旭，張迎春.胸腺細胞體外培養對細胞凋亡和細胞周期進程的影響〔J〕. 白求恩醫科大學學報，1995;15(21)：447.

4 鞠桂芝，付士波，劉建香，等.X射線照射對EL-4淋巴瘤細胞周期進程及細胞倍增時間的影響〔J〕.輻射研究與輻射工藝學報，1998;18(16)：157-60.

5 高沛永，王 瓊.秋水仙堿引起CHL細胞有絲分裂紡錘體損傷的觀察〔J〕.軍事醫學科學院院刊，1993;13(4)：259-61.

6 戴 軍.人參當歸可能誘發乳腺癌 專業人士建議婦女慎用〔J〕.保健時報，2004;20(4)：1.