氣相色譜法檢測牛奶中脂肪酸組分方法的改進(jìn)

李云龍，楊章平，常玲玲，冀德君，王小龍，甘宗輝，劉 姍，劉賢慧

（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

牛奶中脂肪酸主要是甘油三酯，此外還含有少量磷脂和甾醇。脂肪酸主要分為三類：第一類為水溶性揮發(fā)性脂肪酸，如丁酸、乙酸等；第二類為非水溶性揮發(fā)性脂肪酸，如十二碳酸等；第三類是非水溶性不揮發(fā)性脂肪酸，如十四碳酸等［1］。牛乳脂肪中含有C20～C23的奇數(shù)碳原子脂肪酸，也發(fā)現(xiàn)有帶側(cè)鏈的脂肪酸。乳脂中的不飽和脂肪酸主要是油酸，約占不飽和脂肪酸總量的70%左右。乳脂肪的組成受飼料、營養(yǎng)、環(huán)境、季節(jié)等因素的影響［2］。一般夏季乳中不飽和脂肪酸含量升高，而冬季不飽和脂肪酸含量下降。

牛奶中脂肪酸的檢測方法可以分為好幾種，比較粗略的分析方法有紫外分光光度法和紅外分析，根據(jù)光譜中吸收峰的位置和形狀來推斷未知物結(jié)構(gòu)，依照特征吸收峰的強度測定各組分的含量［3，4］。近幾十年來，銀離子高效液相色譜（Ag＋－HPLC））廣泛用于分離飽和度不相同的脂肪酸有效方法，流動相中添加銀離子后，可降低帶有不飽和雙鍵化合物的保留時間。

Ag＋－HPLC能有效地完成共軛亞油酸甲酯順、反幾何異構(gòu)體的分離［5］。目前，脂肪酸測定普遍使用氣相色譜法（GC－FID），大多數(shù)科學(xué)研究人員也把GC－FID作為測定總脂肪酸含量的重要工具。極性毛細(xì)管柱的高溶解性，使得氣相色譜法（GC）能順利完成分析和定量的任務(wù)［6］。此外，氣質(zhì)連用方法（GC－MS）準(zhǔn)確的分析不同脂肪酸所含的碳原子數(shù)，對同分異構(gòu)體還能確定雙鍵所在的位置，因此，如果采用適宜的衍生化方法，GC－MS是用于鑒定分析共軛亞油酸（CLA）異構(gòu)體的非常有用的工具［7］。本研究建立了極性毛細(xì)管氫離子火焰檢測方法（GCFID），用來檢測牛奶中脂肪酸的組成和含量，為研究牛奶中脂肪酸的變化規(guī)律奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

采集揚大農(nóng)牧場150頭中國荷斯坦奶牛的奶樣，奶樣為早：中：晚＝4∶3∶3的混合奶樣，－20℃冷凍保存，用于脂肪酸組成與含量的分析。

1.2 主要儀器和試劑

氣相色譜儀為Agilent 7890A，c9，t11CLA甲酯和t10，c12CLA甲酯購自美國Matreya公司，37種脂肪酸混標(biāo)和c18∶1trans－11（TVA）標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。

1.3 本實驗優(yōu)化的脂肪酸氣相色譜檢測方法

脂肪酸的前處理參照GB／T21676－2008《乳與乳制品脂肪酸測定氣相色譜法》［8］，采用 Agilent HP－88專用脂肪酸甲酯毛細(xì)管柱。氣相色譜檢測條件：進(jìn)樣口溫度250℃，分流比20∶1，檢測器溫度260℃，載氣為高純度氮氣，流速為1mL／min，采用程序升溫步驟，初始溫度140℃，保持5min，以6℃／min升溫到200℃，保持20min，再以2℃／min升溫到220℃，保持20min。

1.4 定性和定量方法

以保留時間定性，以面積百分比法定量。

2 實驗結(jié)果

2.1 氣相色譜檢測結(jié)果

在上述優(yōu)化的氣相色譜檢測條件下，先進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品，檢測結(jié)果見圖1，37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品、2種CLA標(biāo)準(zhǔn)品和TVA標(biāo)準(zhǔn)品得到很好的分離，再用同樣的方法檢測牛奶樣品中脂肪酸的組成（圖2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸的保留時間可以定性，根據(jù)樣品中脂肪酸的峰面積可以用面積百分比定量。表1所表示的是在牛奶中所檢測到的各種脂肪酸的比例和變化范圍。

2.2 樣品的加標(biāo)回收率測定

圖1 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖

圖2 原料乳脂肪酸色譜圖

取0.5mL樣品液（c9t11CLA濃度已知0.322 mg／mL）6份，濃度計為C1，分別加c9t11CLA標(biāo)準(zhǔn)液（c9t11CLA 0.5mg／mL）0.5mL，濃度記為 C2，作為加標(biāo)樣品液，組分含量為C，按上述GC檢測條件測定加標(biāo)樣品液組分C的含量。回收率（%）＝C／（C1＋C2）×100%，結(jié)果見表2。平均回收率為99.588%，由此可見該方法檢測具有很高的準(zhǔn)確度。

2.3 精密度檢測

平行測定樣品6次，其測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。可以看出此方法具有很好的重現(xiàn)性。

表1 原料乳中各脂肪酸含量及變化范圍（M±SD）

表2 回收率測定結(jié)果

表3 精密度測定結(jié)果

3 討論

在食物脂肪酸的分析技術(shù)中，樣品預(yù)處理在整個分析過程中至關(guān)重要，其中樣品預(yù)處理的一個主要方法就是使被測物生成衍生物的方法，而甲酯化方法是目前衍生化方法中最常用、最有效的方法［9］。Christie（1982）［10］的方法一直被認(rèn)為是經(jīng)典的甲酯化方法。卜登攀在乳脂分離和甲酯化方法上做了優(yōu)化研究，共采用4種方法，結(jié)果表明：采用高速離心或者高速離心結(jié)合有機(jī)溶劑分離乳脂肪后采用酸堿甲酷化，不僅對于乳脂大部分常規(guī)脂肪酸組成沒有顯著的影響，同時能彌補乳脂肪提取時存在耗時、工作量大、環(huán)境污染、成本高和處理效率低的缺陷。王小靜［2］采用離心加有機(jī)溶劑提取脂肪酸，用堿性方法甲醇－甲醇鈉甲酯化后，進(jìn)行氣相色譜分析，測得的回收率為100.14%，精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.77%。本研究采用國標(biāo) GB／T21676－2008的方法進(jìn)行甲酯化，先用有機(jī)溶劑提取脂肪酸，再用氫氧化鉀甲醇和三氟化硼進(jìn)行甲酯化，甲酯化在95℃水浴鍋中短時間進(jìn)行，因為有研究表明甲酯化溫度過低會造成甲酯化不完全，而長時間高溫甲酯化又會產(chǎn)生異構(gòu)體，影響檢測結(jié)果［11］。本實驗結(jié)果與王小靜的結(jié)果相比較，在檢出的脂肪酸種類上多出10種，有可能是所用的標(biāo)準(zhǔn)品脂肪酸種類含量較多，可以用于定性的脂肪酸種類相應(yīng)增加，與卜登攀的實驗結(jié)果較一致，只是在個別脂肪酸cis12C18∶1、C20∶4和C20∶5上有所區(qū)別。在GC分析時所選用柱子的類型和長度均對分析結(jié)果有很大的影響。柱子的固定相決定了柱子的性質(zhì)和用途，柱子的長度決定了對物質(zhì)分離的好壞，為了得到較好的分離效果，在本實驗中，采用安捷倫Agilent HP－88極性非常強的脂肪酸甲酯測定專用毛細(xì)管柱是非常必要的［12］。此外，程序升溫法在氣相色譜檢測中還是必要的，它可以按照組分沸點的不同連續(xù)地隨時間線性或非線性逐漸升高，使柱溫與組分的沸點相互對應(yīng)，以使低沸點組分和高沸點組分在色譜柱中都有適宜的保留、色譜峰分布均勻且峰形對稱。

總之，采用毛細(xì)管氣相色譜一氫火焰離子化檢測器測定乳脂中脂肪酸組成的方法具有樣品前處理簡單、耗用試劑少，靈敏度及回收率高，重現(xiàn)性好等諸多特點。該方法不僅可以做定性分析，還可以做定量分析，對于乳制品來源的其它脂肪酸含量的測定也具有指導(dǎo)意義，很適宜推廣應(yīng)用。

［1］ 周光宏.畜產(chǎn)品加工學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002，177－178.

［2］ 王小靜.調(diào)控反芻動物消化代謝提高乳脂中共軛亞油酸含量及其機(jī)理的研究［D］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［3］ Allen J C，Hamilton R J.Rancidity in foods［M］.Elsevier Applied Science，1987，21－45.

［4］ Mossoba M M，McDonald R E，Prosser E R.GC matrix－isolation Fourier－transform infrared spectroscopic determination of trans－monounsaturated and saturated fatty acid methyl esters in partially hudrogenated menhaden oil［J］.Agric.Food Chem，1993（41）：1998－2002.

［5］ Delmonte P，Kataoka A，Cori B A，et al.Relative retention order of all isomers of cis／trans conjugated linoleic acid FAME from the 6，8－to13，15－positions using silver ion HPLC with two elution systems［J］.Lipids.2005，40（5）：509－514.

［6］ Kramer J K，Blaekadar C B，Zhou J Q.Evaluation of two GC columns（60－m SUPELCO WAX 10and l00mCP sil 88）for analysis of milk fat with emphasis on CLA，18∶1，18∶2and 18∶3isomers，and short－and long－chain FA［J］.Lpids.2002，37（8）：823－835.

［7］ Dobson G.Gas chromatography－mass spectrometry of conjugated linoleic acids and metabolites［J］.AOCS Press.20（3），2：13－36.

［8］ GB／T21676－2008《乳與乳制品脂肪酸的測定氣相色譜法》.

［9］ 陳定一.分析化學(xué)（下冊儀器分析）［M］.北京，學(xué)苑出版社，1995，165－173.

［10］ Christie W W.A simple procedure for rapid transmethylation of glycerolipids and cholesteryl esters［J］.Lipid Res，1982，23（7）：1072－1075.

［11］ John A G，Roach M M，Mossoba M.chromatographic separation and identification of conjugated linoleic acid isomers［J］.Analytica Chimica Acta，2002，465（12）：207－226.

［12］ Banni S，Angioni E，Casu V，et al.Decrease in lionleic acid metabolites as a potential mechanism in caneer risk reduction by conjugated linoleic acid［J］.Carcinogenesis.1999，20（6）：1019－1024.