雙向凝膠電泳和二維色譜技術檢測大腸癌蛋白質譜的意義

李 峰 師慶紅 張曉靜 何成彥 趙麗純 郭宏華 (吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 30033)

大腸癌(colon cancer)是一種常見的消化道惡性腫瘤，死亡率在世界范圍內居各種腫瘤的第三位，在西方居第二位，并且發病率和死亡率均有逐年上升的趨勢〔1，2〕。大腸癌的發生和發展受到基因和環境等多種因素的影響，其病理機制復雜，從單一的基因突變和分子通道的變化難以全面理解大腸癌的發生機制。蛋白質組學是近年來發展起來的新興學科，已經廣泛應用于腫瘤研究的諸多方面。本文擬采用雙向凝膠電泳和二維色譜技術分析Dukes B期大腸癌腫瘤與癌旁組織蛋白質的差異性，為大腸癌的早期診斷、生物學治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集吉林大學中日聯誼醫院手術治療的大腸癌患者18例，年齡49～78歲，其中男13人，女5人。在手術中獲得的癌組織均是新鮮標本。所獲得的癌旁正常組織均距離癌邊緣10 cm之外、切緣正常組織，并且所取的正常組織標本均是在癌組織上端。標本離體后立即取材，生理鹽水沖洗，放入液氮冷凍，－80℃保存。病人術前未接受任何治療。取部分組織標本進行石蠟包埋、切片、HE常規染色，病理學檢查證實組織類型，均是Dukes B腺癌。

1.2 主要試劑 載體兩性電解質(Bio－Lyte 3－10)、IPG預制膠條(pH3～10，17 cm;pH5～8，17 cm)、礦物油、碘代乙酰胺(IAA)購自 Bio－Rad 公司(Hercules，CA，USA)。尿素、硫脲、精胺、蔗糖、甘油、三羥甲基氨基甲烷、3－〔(3－膽酰胺丙基)－二乙胺〕－丙磺酸(CHAPS)、丙烯酰胺、N，N，N′，N′－四甲基乙二胺(TMED)、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴酚藍、考馬斯亮藍G－250、苯甲基磺酰氟(PMSF)購于 Sigma 公司(St Louis，MO，USA)。低熔點瓊脂糖、甲叉雙丙烯酰胺、DTT、TPCK修飾的測序級胰酶購自Promega公司。過硫酸銨、碳酸氫氨、硝酸銀、甲醛、乙醇、硫代硫酸鈉、冰乙酸為國產分析純。蛋白質定量試劑盒(RC DC Protein Assay Kit)購于Bio－Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 雙向凝膠電泳技術和質譜技術鑒定大腸癌腫瘤與癌旁組織的差異蛋白質組 利用裂解緩沖液制備腫瘤組織與癌旁組織總蛋白，然后分別取腫瘤組織與癌旁組織總蛋白各1 mg，分別加入水化上樣緩沖液至終體積300 μl。經pH 3～10等電聚焦分離和 SDS－PAGE電泳分離后，考馬斯亮藍染色，利用PDQUEST軟件對電泳圖像進行分析、剪切，建立匹配組并進行歸一化處理。最后建立分析組，比較匹配點之間光吸收度的差異，獲得腫瘤組織與癌旁組織總蛋白質的差異蛋白表達譜。

1.3.2 二維色譜技術和質譜技術鑒定大腸癌腫瘤與癌旁組織的差異蛋白質組 首先利用裂解緩沖液制備腫瘤組織總蛋白，然后分別用25 mmol/L NH4HCO3稀釋，使尿素濃度低于2 mmol/L。經酶解后，將酶解產物進行二維液相色譜與質譜聯用分析，得到腫瘤組織酶解混合物的多肽質譜數據。

2 結果

2.1 雙向凝膠電泳技術和質譜技術

2.1.1 腫瘤組織與癌旁組織的差異蛋白表達譜 腫瘤組可分離(614±36)個蛋白點，癌旁組可分離(682±24)個蛋白點，匹配率為83.3%。其中腫瘤組織中21個蛋白質點的表達量有顯著差異，其中有14個表達上調，有7個表達下調。

2.1.2 21個差異蛋白質點的質譜鑒定 直接切取21個差異蛋白質點，進行膠內酶切和肽段提取。然后在 MALDI－TOFTOF(DE STR，Applied Bio systems)質譜儀上進行肽質量指紋分析。將得到的數據用Mascot檢索引擎在Swiss Prot數據庫中進行檢索，對21個蛋白質點進行鑒定。

2.2 二維色譜技術和質譜技術

2.2.1 腫瘤組織總蛋白酶解混合物二維色譜與質譜聯用分析共鑒定29825個多肽序列，得到860個蛋白質的鑒定數據。

2.2.2 癌旁組織總蛋白的二維色譜與質譜聯用分析 共鑒定了40388個多肽序列，共得到549個蛋白質的鑒定數據。

2.2.3 腫瘤與癌旁組織差異蛋白質的質譜分析 應用實驗中每個蛋白的圖譜評價其豐度。對于在不同樣品中豐度發生變化的蛋白，其譜圖數變化必須滿足以下原則:①兩個樣品中譜圖數的比值≥1;②兩個樣品中譜圖數的差值≥72(平均每次實驗差值為24)。為評價上述方法用于鑒別蛋白豐度變化的假陽性率，每個樣品進行3次實驗，然后比較結果，相應假陽性率為2.13%。將腫瘤與癌旁組織的蛋白質組分析的結果進行比對，依據上述評價原則及標準得到44個蛋白質具有顯著差異，其中腫瘤組織中21個蛋白表達上調，23個蛋白表達下調。

2.3 雙向凝膠電泳和二維色譜技術的對比 在大腸癌腫瘤組織與癌旁組織差異蛋白中有13個蛋白得到一致的鑒定結果，其中在腫瘤組織中表達上調的蛋白有7個，表達下調的蛋白有6個。見表1。

表1 腫瘤組織表達上調(A1～A7)和下調(B1～B6)的蛋白質鑒定結果

3 討論

雙向凝膠電泳和二維色譜一直是目前蛋白質組學的兩大重要分離技術，雙向凝膠電泳作為傳統的技術手段由于其價格較低、易于操作等特性，一直被大多數實驗室所采用〔3，4〕。但是一些特殊的蛋白質，如:強堿、強酸，過大、過小以及膜蛋白質，現在還不能用雙向凝膠電泳方法進行分離，所以需要發展其他相關技術。而隨著色譜技術的迅猛發展，發展可替代或補充雙向凝膠電泳的新方法成為蛋白質組學研究技術最主要的目標。由于二維色譜質譜聯用技術具有分析范圍廣、分析能力強、定性分析結果可靠、檢測限低、分析時間快、自動化程度高等特點，所以液質聯用技術成為分離、鑒定復雜混合物最有效的手段〔5，6〕。二維色譜(2D－LC)、二維毛細管電泳(2D－CE)、液相色譜－毛細管電泳(LC－CE)等新型分離技術都有補充和取代雙向凝膠電泳之勢。本實驗利用雙向凝膠電泳和二維色譜兩大分離技術對Dukes B期大腸癌腫瘤組織與癌旁組織進行鑒定分析，兩種方法所得到的結果有不一致的地方，主要原因為:①雙向凝膠電泳方法測定的pH范圍相對液質聯用要窄，雙向電泳等電聚焦分離的pH是3～7，而二維色譜方法測定的范圍要比雙向電泳廣;②雙向凝膠電泳在蛋白質提取的過程中必須考慮到去除影響蛋白質可溶性和重復性的物質，比如核酸、脂類、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會降低等電聚焦的電壓，甚至會損壞IPG膠條，這樣都會造成2－DE的失敗，而二維色譜方法分析范圍廣、分析能力強、檢測限低。但兩者共同鑒定出的差異蛋白質對研究大腸癌的發病、轉移及復發機制提供了依據和方向。

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