清開靈注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

趙麗紅 卜麗梅 于艷華 李瓊書 石 卓 (吉林大學白求恩醫學院，吉林 長春 30000)

氧自由基(OFR)對組織細胞的損害是引起再灌注損傷的重要因素之一〔1〕，藥物預處理對缺血再灌注(I/R)損傷心肌的保護亦成為目前的研究熱點。清開靈(QKL)注射液為傳統中藥制劑，對腦I/R損傷具有保護作用〔2〕，但對心肌I/R損傷是否有作用未見報道。本實驗通過觀察麻醉開胸大鼠心肌I/R損傷模型心肌形態學、血清酶學及抗自由基等指標的變化，探討QKL注射液對心肌I/R損傷的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性Wistar大白鼠，清潔級，體重250～280 g，吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供。QKL注射液由北京中藥廠出品;乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷草轉氨酸(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、氧化氮(NO)試劑盒均由南京建成生物工程技術公司提供。COBAS-FARA型自動生化分析儀(瑞士)，HX-200小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，ECG-6511心電圖機(上海光電醫用電子儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及動物模型制備 取Wistar雄性大鼠40只，體重250～280 g，隨機均分四組，每組10只。20%烏拉坦(0.5 ml/100 g)麻醉，仰臥位固定，頸部正中分離氣管行氣管插管，開胸后接呼吸機。小動物呼吸機設定潮氣量為5 ml/100 g、呼吸頻率為68次/min，吸呼比為2∶1，根據呼吸頻率及深度調整呼吸參數。沿胸骨左緣做縱向切口，在3～4肋間開胸，暴露心臟，在左冠狀動脈前降支距左心耳下緣1.5～2 mm處穿線，15 min后取心電圖正常者隨機分組，每組10只，即假手術組、模型組、QKL注射液高劑量組(40 mg/kg)及低劑量組(20 mg/kg)。假手術組:冠狀動脈下穿線不結扎。模型組:結扎左冠狀動脈前降支，以心電圖ST段明顯抬高并與QRS波融合為成功標志。QKL注射液高劑量組:舌下靜脈給藥40 mg/kg，15 min后結扎左冠狀動脈前降支。QKL注射液低劑量組:舌下靜脈給藥20 mg/kg，15 min后結扎左冠狀動脈前降支。以上各結扎組缺血40 min后，均打開結扎線形成再灌注2 h。

1.2.2 檢測大鼠血清LDH、CK、AST、SOD、MDA及NO含量上述實驗結束后，由腹主動脈取血5 ml置于玻璃試管中，并立即離心(4℃，3000 r/min，10 min)分離血清，按 LDH、CK、AST、SOD、MDA及NO試劑盒說明書操作，采用自動生化測定儀，在340 nm處檢測血清LDH、CK、AST、SOD、MDA及 NO含量。

1.2.3 檢測并計算大鼠心肌損傷范圍 腹主動脈采血后，迅速剪下心臟，橫向將心臟切5～6片，每片厚約1.5～2 mm，放入1%氯化三苯基四氮(TTC)磷酸緩沖液(pH7.4)，37℃水浴10 min，損傷的心肌細胞因細胞膜損傷脫氫酶釋放丟失，因而不被染色;正常心肌含有脫氫酶可被染為紅色。應用BI2000軟件處理系統計算各部分面積，以各片非染色區面積之和與各片室壁面積之和的百分比反映心肌損傷范圍。

1.2.4 免疫組化法檢測大鼠心肌誘導型NO合酶(iNOS)的表達 取心尖缺血梗死區橫切2 mm厚心肌，以磷酸鹽緩沖液(PBS)配成10%甲醛溶液固定，以鏈霉菌素-生物素免疫組化(SP)法觀察心肌細胞iNOS表達。操作步驟如下:(1)石蠟切片常規脫蠟至水;(2)3%H2O2常溫下孵育10 min以滅活內源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸洗5 min;(3)加山羊血清封閉液，室溫15 min清除背景非特異性染色;(4)滴加兔抗鼠iNOS抗體37℃孵育1 h;(5)滴加生物素標記羊抗兔IgG，37℃孵育30 min;(6)加辣根酶標記鏈霉素卵白素，37℃孵育30 min;(7)上述(3)、(4)、(5)后均以 PBS洗3 min×3次;(8)二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，封片。陰性對照以PBS代替一抗進行孵育，其他步驟同上。陽性反應:細胞質呈棕褐色為iNOS蛋白陽性表達。Image-pro軟件分析計算各組陽性表達細胞的光密度值。

2 結果

2.1 QKL注射液對大鼠血清CK、LDH、AST、SOD、MDA及NO含量的影響 與假手術組

比較，模型組血清CK、LDH及AST活性明顯升高(P＜0.01);與模型組相比，QKL能降低血清CK、LDH及AST的活性(P＜0.05)。與假手術組比較，模型組大鼠血清中 SOD活性降低，NO、MDA含量明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，QKL各組大鼠血清中SOD活性明顯升高(P＜0.01)，MDA含量和NO含量明顯降低(P＜0.01)。見表 1，表 2。

表1 QKL注射液對大鼠血清CK、LDH及AST的影響(n=10， ± s，U/L)

表1 QKL注射液對大鼠血清CK、LDH及AST的影響(n=10， ± s，U/L)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

328.12±159.4 330.3±64.2 104.4±40.6模型組 1230.4±213.51)1193.0±223.11)436.0±106.41)QKL高劑量組 886.3±97.81)2)894.25±280.31)2)294.7±67.51)2)QKL低劑量組 857.9±118.31)2)776.9±312.41)2)304.1±66.61)2)CK LDH AST假手術組組別

±s)表2QKL注射液對大鼠血清SOD、MDA及NO的影響(n=10，

±s)表2QKL注射液對大鼠血清SOD、MDA及NO的影響(n=10，

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;下表同

組別 SOD(U/ml) MDA(μmol/L) NO(μmol/L)168.04±4.58 5.40±0.86 12.45±2.16模型組 106.22±5.921) 10.92±1.121) 25.3±8.11)QKL高劑量組 135.31±9.321)2)6.98±1.131)2) 16.2±3.01)2)QKL低劑量組 131.56±8.661)2)7.94±0.951)2) 17.7±4.81)2)假手術組

2.2 QKL注射液對心肌損傷范圍的影響 與假手術組比較，模型組心肌梗死面積(MIS)〔(42.30±2.5)%〕明顯增大(P＜0.01)，表明大鼠心肌I/R模型建立成功。與模型組相比，QKL(40 mg/kg)組及 QKL(20 mg/kg)組均能明顯縮小 MIS〔(32.16±3.8)%，(31.43±4.6)%，P ＜0.05〕。

2.3 QKL對iNOS的影響 鏡下可見iNOS主要在胞質中表達，陽性細胞被染成棕黃色。I/R后各組心臟心肌均出現iNOS表達增強，模型組iNOS染色陽性細胞數(92.33±11.34)高于假手術組(40.15±5.69，P＜0.01)，而 QKL高、低劑量組(73.92±14.29，76.76±12.45)與模型組比較陽性細胞數減少(P＜0.01)，胞質表達的棕黃顆粒明顯減少。

3 討論

本研究采用人工結扎大鼠冠脈左前降支制備心肌急性心肌I/R損傷模型，急性心肌梗死后，各項心功能改變及其恢復程度和速度均與MIS呈負相關，故縮小MIS為抗心肌缺血藥物的主要療效指標。此外，心肌發生缺血壞死，其生理功能、生化代謝方面也隨之發生相應變化。一般認為，阻斷冠脈血流20～30 min內重新供血，心肌病變可以逆轉，但長時間缺血缺氧會導致心肌組織細胞損傷，使廣泛存在于心肌組織細胞內的CK和LDH釋放出來并擴散入血，血清CK、LDH活性顯著升高，其升高程度與心肌梗死程度相平行。因此，血清CK、LDH水平是心肌損傷的靈敏指標〔3〕。本研究證明，QKL能降低心肌缺血大鼠血清CK和LDH活力，表明其可減輕細胞損傷，并且與其縮小MIS的結果一致。

心肌組織I/R后，細胞膜脂質微環境發生紊亂，自由基大量產生及自由基引發的脂質過氧化作用增強，同時自由基生成和自由基消除之間的平衡被破壞，自由基嚴重增多，自由基清除劑SOD減少，而活性很強的OFR與細胞膜上的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，其過氧化產物MDA對膜有很強的破壞作用，可破壞心肌細胞膜的完整性，改變心肌超微結構，從而加劇心肌缺血，導致心肌細胞損傷〔4〕。檢測MDA含量可反映機體內脂質過氧化程度，間接反映出細胞損傷的程度。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它們是OFR的特異性降解酶，該酶能清除OFR保護細胞免受損傷，其活力的高低間接反映了機體清除OFR的能力。心肌缺血再灌注損傷時早期主要表現為心肌酶漏出。其中血清CK以靈敏度高、特異性強、發生變化時間早、持續時間長的特點而經常作為首選酶，臨床常把CK作為診斷心肌梗死和判斷其梗死程度的指標之一〔5〕。本實驗結果顯示，QKL能升高結扎冠脈引起的急性心肌缺血大鼠血清中LDH的含量，減少MIS，表明QKL能增強機體對OFR的清除能力，減少細胞膜脂質過氧化損傷，維持膜結構的完整性，抑制細胞內CK外漏，從而對心肌細胞膜起到保護作用，減少LDH的釋出，縮小MIS。

過量的NO能與超氧自由基或O2形成過氧亞硝酸根離子(ONOO－)和羥自由基(OH)，損傷線粒體膜，使線粒體形成瘺道，開放線粒體轉換孔，致使離子平衡紊亂，大量的Na+和Cl－進入細胞內，導致細胞內水增加引起細胞腫脹，ATP能量合成終止，導致細胞壞死和凋亡〔6〕。NO的毒性作用還表現在通過產生大量的OH－和二氧化氮自由基，直接造成蛋白質、核酸、膜脂質的損傷，抑制各種與線粒體電子傳遞有關的酶類，從而抑制線粒體呼吸鏈的功能〔7〕，最終導致細胞壞死或凋亡。本實驗發現，假手術組心肌組織iNOS活性增加，提示I/R誘發iNOS系統功能紊亂，與iNOS活性相關的NO合成增加，將發揮NO的細胞毒性作用。QKL組預處理后iNOS活性下調，這可能因為QKL可保護血管內皮細胞并逆轉NOS系統的功能紊亂，減少再灌注期由iNOS誘導的NO生成，從而抑制ONOO－生成及細胞損傷，對心肌I/R損傷具有一定的保護作用。

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2 黃真炎，吳玲霓，楊冬娣，等.清開靈對大鼠急性腦缺血超微結構的保護作用〔J〕.中醫藥研究，1997;13(5):57-8.

3 黃秀蘭，王 偉，周亞偉.淫羊藿總黃酮注射液對大鼠實驗性心肌缺血的保護作用〔J〕.中國中西醫結合雜志，2006;26(1):68-71.

4 中國醫學科學院心血管病研究所基礎研究室.血清肌酸激酶在急性心肌梗塞診斷中的價值〔J〕.心血管疾病，1974;2:278.

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