IL-10單核苷酸多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)性研究

李貞娟，張彩鳳，韓 宇，文廷玉，董良鵬，張秀英

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝453100)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種發(fā)生于結(jié)直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，其病因可能與遺傳易感人群在多因素作用下所引起的腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)相關(guān)［1］。IL-10作為炎癥抑制因子，能夠抑制UC患者中Th1型細(xì)胞因子的分泌，在其發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。IL-10分泌量主要由遺傳決定，而且主要受轉(zhuǎn)錄水平控制。研究表明，IL-10基因啟動子區(qū)域主要有3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs):IL-10－592(C→A)、IL-10－819(C→T)、IL-10－1082(G→A)，IL-10啟動子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)與其在血清中的蛋白表達(dá)關(guān)系密切。本研究就IL-10啟動子區(qū)IL-10－1082/－819/－592位點(diǎn)SNPs及其在 UC患者血清中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行探討，為UC分子及基因水平的診斷、治療、預(yù)后評估及相關(guān)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年5月～2010年8月于我院就診的門診及住院UC患者60例(UC組)，均符合全國炎癥性腸病診療規(guī)范共識意見［2］。其中輕度24例、中—重度36例;年齡(43.30±11.60)歲。對照組40例，男22例、女18例，年齡(40.21±10.32)歲，均系我院健康體檢者，均無血緣關(guān)系。兩組年齡及性別均衡可比。

1.2 方法

1.2.1 血清IL-10的檢測 應(yīng)用ELISA法測定IL-10。患者于清晨空腹采肘靜脈血3 mL，離心取血清，置－20℃保存待測。

1.2.2 IL-10基因型檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性法檢測IL-10－592A/C、IL-10－1082 A/G基因型。收集UC組及對照組外周靜脈血5 mL，應(yīng)用EDTA-K2抗凝，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心去上清，重懸白細(xì)胞，再加入白細(xì)胞裂解液裂解白細(xì)胞，按照常規(guī)酚:氯仿:異戊醇抽提法提取基因組DNA，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后－80℃儲存?zhèn)溆谩L-10－592A/C、IL-10－819 T/C、IL-10－1082A/G三個(gè)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物，由上海生工公司負(fù)責(zé)合成。三個(gè)位點(diǎn)均采用特異性引物擴(kuò)增方法。引物序列見表1。IL-10－592A/C位點(diǎn)和IL-10－1082A/G位點(diǎn)擴(kuò)增片段長度分別為412 bp、139 bp，PCR 的擴(kuò)增體系為 25 μL，含0.5 U Taq酶，模板基因組 DNA(25 ng/μL)1 μL，10×PCR Buffer緩沖液2.5μL、10 pmol/L上游引物和下游引物各2 μL，MgCl2(2.5 mmol/L)1.5 μL，加水至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)后取10μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入5 U限制性內(nèi)切酶(RsaⅠ消化－592位點(diǎn)或MnlⅠ消化－1082位點(diǎn))，37℃消化8 h。消化產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后進(jìn)行結(jié)果判讀。RsaⅠ酶切為175、237 bp兩個(gè)片段的是－592AA純合型，不能切開的412 bp產(chǎn)物為－592CC純合型，同時(shí)具有412、237、175 bp 3個(gè)片段的是－592雜合型。MnlⅠ酶切－1082(G/A)，G等位基因被切斷，產(chǎn)生106和33 bp兩個(gè)片段的是－1082GG純合型，139 bp的是 －1082AA純合型，產(chǎn)生139、106和33 bp 3個(gè)電泳條帶的是－1082G/A雜合型。IL-10－819C/T擴(kuò)增片段長度為402 bp。擴(kuò)增反應(yīng)條件為63℃退火30 s，其余條件同上。上游引物1與下游引物3擴(kuò)增后在402 bp處出現(xiàn)電泳條帶為等位基因TT純合型，上游引物2與下游引物3擴(kuò)增后在402 bp處出現(xiàn)電泳條帶為等位基因CC純合型。在兩對引物擴(kuò)增后402 bp處均存在電泳條帶為CT雜合子。

表1 各基因位點(diǎn)引物序列

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，均數(shù)以ˉx±s表示，比較采用T檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清IL-10的表達(dá) IL-10在UC組(輕度、中—重度)及對照組血清中的表達(dá)分別為(17.3±1.4)、(10.8 ± 2.2)、(18.2 ± 2.6)ng/mL，輕度UC患者血清IL-10水平與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中—重度UC患者血清IL-10水平較對照組顯著降低(P＜0.05)。

2.2 兩組IL-10三個(gè)位點(diǎn)SNPs的表達(dá)情況 －592和－819位點(diǎn)基因型高度連鎖，即－592CC和－819CC、－592CA和 －819TC、－592AA和 －819TT總是同時(shí)出現(xiàn)。見表2。

表2 兩組IL-10三個(gè)位點(diǎn)SNPs比較［例(%)］

3 討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為IL-10的缺乏與UC的發(fā)生關(guān)系密切，IL-10是一種多效性細(xì)胞因子，具有抑制炎癥與促進(jìn)炎癥的雙重作用［3，4］，在UC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

人類編碼IL-10基因位于染色體lq31-32上，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，啟動子區(qū)域有多個(gè)SNPs。目前對于IL-10基因啟動子多態(tài)性的研究，大多數(shù)集中于－1082G/A、－819T/C和 －592A/C三個(gè)位點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞因子SNPs可能與其在細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄功能不同有關(guān)［5，6］。IL-10是機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的重要成分。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外，刺激不同個(gè)體的全血細(xì)胞，其產(chǎn)生IL-10的能力顯著不同［7］，根源在于IL-10基因啟動子的多態(tài)導(dǎo)致其mRNA合成率不同［8］。因此，個(gè)體表達(dá) IL-10的能力主要取決于其遺傳背景。新近研究發(fā)現(xiàn)，IL-10基因啟動子區(qū) －1082G/A、－819C/T、－592C/A位點(diǎn)的SNPs與IL-10基因的轉(zhuǎn)錄活性以及血漿中IL-10的水平有關(guān)。

本文對60例UC患者和40例健康人血清IL-10水平及IL-10三個(gè)位點(diǎn)的SNPs進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，UC中—重度患者血清中IL-10含量較健康人顯著升高，而UC輕度患者血清中IL-10含量與健康人之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IL-10有 －592、－819和 －1082三個(gè) SNPs位點(diǎn)，IL-10－592位點(diǎn)和 IL-10－891位點(diǎn)AA型和AC型在UC組分布相同，且均高于對照組。UC組IL-10－592位點(diǎn)和IL-10－891位點(diǎn)CC型分布頻率低于對照組，提示IL-10－592位點(diǎn)和IL-10－891位點(diǎn)C基因?qū)C的發(fā)病影響更大，且影響IL-10的表達(dá)。眾多研究表明，IL-10－819位點(diǎn)與－592位點(diǎn)等位基因緊密連鎖［9～11］。本研究也發(fā)現(xiàn)，IL-10啟動子等位基因分布存在－592A等位基因與－819T等位基因總是同時(shí)出現(xiàn)，是高度連鎖的。Turner等［12］研究表明，IL-10啟動子區(qū)域的幾個(gè)SNP與IL-10的分泌水平相關(guān)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處－1082G/A的替換改變了機(jī)體合成IL-10的能力，－1082與 IL-10的高產(chǎn)量相關(guān)，而 －1082A則與IL-10的低產(chǎn)量相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IL-10－1082位點(diǎn)AA型在UC組較對照組表達(dá)明顯增加，IL-10－1082位點(diǎn)GG型較對照組明顯下降，二者在UC中變化趨勢是截然相反的。提示IL-10－1082位點(diǎn)A基因和G基因均影響IL-10的表達(dá)，UC患者IL-10－1082位點(diǎn)A基因表達(dá)增加，IL-10－1082位點(diǎn)G基因表達(dá)下降，而UC患者血清中IL-10表達(dá)是下降的，與Turner等［12］研究相似。提示血清中IL-10的表達(dá)水平或IL-10啟動子區(qū)的不同基因型可以反映UC的發(fā)病敏感性或活動度。

目前的研究表明，UC IL-10連鎖基因及易感基因的多態(tài)性與其發(fā)病的易感性密切相關(guān)，但其機(jī)制尚未完全明了，仍待大樣本、多民族、多人種的比較性研究進(jìn)一步明確，從而更加全面地理解 IL-10 SNPs在UC發(fā)病中的作用。

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