鞘內注射HPPE修飾的HEK293對骨癌痛大鼠脊髓背角pCREB表達的影響

段志祥 楊保仲 薛朝霞 郭寅南 段金緯

隨著國內外診斷以及治療技術的進步，癌癥患者的生命質量已經得到很大的提高，但是癌癥所引起的疼痛卻使患者的生活質量大大降低。資料顯示，全球每天有將近1500萬患者經受癌痛的折磨[1-2]。骨癌痛是一種劇烈的、頑固性的疼痛，通常是由骨骼原發性腫瘤或者其他部位的腫瘤轉移至骨，具有自發性痛、痛覺過敏和痛覺超敏的特征[3-4]。對于骨癌痛，傳統的止痛藥物存在不良反應多，成癮性高的缺點。利用外源性阿片肽基因-人前腦啡肽原基因（HPPE)治療骨癌痛則是一種新型的治療方式。本課題組前期已將攜帶有HPPE基因的慢病毒載體PSB251(pLV-UbCHPPE），包裝后感染HEK293細胞，篩選出穩定表達細胞pLVUbC-HPPE/HEK293(HH細胞)。以及該細胞的陰性對照細胞UbC-GFP-LV/HEK293（GH細胞)。本研究擬通過向大鼠鞘內注射HH細胞，觀察其對骨癌痛大鼠行為學和脊髓背角pCREB表達的影響，探討其鎮痛作用。

1 資料與方法

1.1 動物選擇以及分組 48只純種清潔級雌性SD大鼠，體重200～220g(編號1103002)，購自河北省實驗動物中心。動物飼養溫度20～24℃，自由進食，飲水。實驗前，動物應適應環境1周。隨機分成2組，分別命名為假手術(SHAM)組（12只），骨癌痛(CIBP)組（36只）。

1.2 骨癌痛模型的制備 CIBP組大鼠麻醉后，左后肢剪毛，消毒，分離暴露左側脛骨靠近干骺端骨面，打孔。微量進樣針將5ul MADB-106大鼠乳腺癌細胞株（購自武漢大學典型培養物保藏中心）懸液緩慢注入骨髓腔內，針孔用無菌骨蠟密封，逐層消毒縫合[5]。手術過程及相關手術器械均按照無菌手術標準嚴格執行。SHAM組按上述手術流程向骨髓腔內注入5ul 0.9%生理鹽水。術畢注意動物保溫，待其蘇醒后送回籠中繼續飼養。

1.3 熱刺激縮足反射潛伏期PWL測定及影像學觀察 利用IITC39熱盤儀（美國IITC Life Science 公司）行熱板實驗，于術前1d，術后7、14、21d測定大鼠PWL。根據Eddy和Leimbach[6]法，將熱盤儀溫度調節至（55.0±0.5）℃，記錄自大鼠放在熱盤儀至舔咬后爪時間，即熱刺激縮足反射潛伏期（熱痛覺閾值）。選擇基礎痛閾5～20s的大鼠做測量，經過熱板實驗篩選，反應異常鼠被剔除。每只大鼠測量3次，間隔5min，取其均值。為防止大鼠后爪被熱板燙傷，確定30s的時間為其中斷時間，超過30s的按照30s計算。在測試過程中應該使熱板表面清潔干燥，遇到大鼠有糞便和尿液污染后應及時清除并擦凈熱盤。

動物麻醉后在各時點用X線對大鼠造模側進行拍攝，觀察腫瘤細胞對脛骨的侵襲破壞程度。

1.4 大鼠蛛網膜穿刺置管術 根據Storkson[7]法行蛛網膜腔穿刺：麻醉，俯臥位，腰部墊一圓筒，從兩側髂棘定位至L6，剪毛，消毒，鋪無菌洞巾，沿背部正中切開約1cm，切開外筋膜，分離背脊肌，暴露L5～L6棘突間隙。挑破黃韌帶以及硬脊膜，經黃韌帶插入導管時，可見典型的大鼠甩尾動作。向頭端置入蛛網膜下腔2cm，導管另外一端可見清亮的腦脊液流出。將導管加固于韌帶上以防脫落，逐層縫合。用50ml注射器針頭從大鼠背部皮下穿過至頸部，將導管從大鼠頸部引出。外露2～3cm，用熱熔法封住導管外口，防止腦脊液的外漏，消毒縫皮，放回籠子單養。

1.5 鞘內注射，拮抗劑納洛酮實驗以及PWL測定 CIBP組骨癌痛模型造成后，測定PWL。隨機分為三組，分別命名為CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH組，均12只。據涂會引[8]法打開鞘內置管封口，回抽有腦脊液流出，用微量注射針分別向CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH組注射PBS液，GH和HH細胞懸液各20ul，然后用15ul人工腦脊液沖入。整個給藥過程慢速均勻，15s內注射完畢,封閉管口。隔天，共3次。術后密切關注大鼠情況，避免大鼠顱內高壓的產生。CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH組鞘內注射后，測定大鼠PWL。

CIBP′+HH組大鼠腹腔注射納洛酮(0.8mg/100g)，再次測定PWL。

1.6 免疫組化染色 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，大鼠仰臥位固定鼠板上，迅速剪開大鼠胸膛暴露心臟，經主動脈建立通路，依次灌入生理鹽水250ml，4%的多聚甲醛500ml，待全身僵硬后解剖，取脊髓L4～L6置于4%多聚甲醛中再固定2h，入30%蔗糖脫水，過夜沉底，行冰凍冠狀切片，切片厚度20um，選片，SABC免疫組織化學技術染色（即用型SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德公司）：按1:1滴加5%BSA封閉液和triton x-100（AMRESCO公司，美國）。2h后加兔抗pCREB(1:100，Bioworld Technology公司，美國)，4℃冰箱孵育過夜。滴加二抗，室溫孵育30min后，加入SABC（鏈霉親和素-生物素-酶復合物），室溫下孵育30min,DAB顯色，硫酸鎳胺加強顯色。貼片，晾干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每只大鼠選取5張切片，用奧林巴斯BX51顯微鏡（Olympus，日本）觀察脊髓背角灰質Ⅰ，Ⅱ層，pCREB免疫組化染色以細胞核內出現棕褐色顆粒細胞為陽性，用image-pro Plus6.0軟件分析，測定pCREB陽性細胞數。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，p-CREB細胞計數為計量資料采用均數±標準差（χ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察 CIBP組造模術后7d、14d、21d，大鼠行為學逐漸發生改變，出現疼痛引起的自發性縮足反射，并呈進行性加重，造模側出現活動能力逐漸下降直至拖地行走。而SHAM組左右肢未出現此種現象。

2.2 骨癌痛模型大鼠造模側脛骨X線觀察 大鼠術前1d，術后7d并未見異常情況（圖B），14d可見接種的部位有放射性缺失病灶（圖C)，21d顯示可有骨破壞，骨皮質的缺失(圖D）(見圖1）。

圖1 脛骨X線觀察。A:術前1d，B:術后7d，C:術后14d，D:術后21d。

2.3 PWL測定 SHAM組：造模術前術后PWL相比沒有發生變化。CIBP組：與術前1d PWL相比，術后7d時PWL開始下降（P<0.05)，術后14d、21d PWL值進一步下降（P<0.05)，均具有統計學意義。

注射PBS，GH細胞和HH細胞后，CIBP′+HH組PWL值與CIBP′和CIBP′+GH組相比均有了增加（P<0.05)。CIBP′+HH組大鼠腹腔注射納洛酮后PWL與鞘內注射后的值相比降低（P<0.05)，30min后恢復（見表1、2）。

表1 大鼠骨癌痛組與對照組各時點PWL變化比較

表2 大鼠各時點PWL值變化比較（s,χ±s)

2.4 各組大鼠脊髓背角pCREB陽性細胞數表達 SHAM組脊髓背角神經元pCREB染色淺，且陽性細胞數少，為（13.87±2.76）。CIBP′組大鼠脊髓背角神經元pCREB染色較深，且陽性細胞數較多，為（54.21±5.03）。CIBP′+GH組陽性細胞數為（53.53±5.16），與CIBP′組比（P>0.05)。CIBP′+HH組陽性細胞數，為（38.73±3.92），與CIBP′組相比,大鼠脊髓背角pCREB染色變淺，陽性細胞數量也變少，pCREB表達量降低（P<0.05)(見圖2）。

3 討論

本實驗首先建立大鼠骨癌痛模型。接種癌細胞7d、14d、21d后發現大鼠出現舔足，懸空等自發性痛行為，造模側活動能力進行性下降；熱板實驗檢測PWL明顯降低；大鼠造模側脛骨X線也表明大鼠骨癌痛動物模型成功建立。骨癌痛的具體發生機制目前仍不清楚，其本身是一種非常復雜的慢性疼痛。研究表明[9]，骨癌痛有著慢性炎癥痛和神經病理性痛的一些特征，但不是兩者的簡單相加，有著其獨自的特征。腫瘤生長過程中分泌的前列腺素、白細胞介素1、內皮素等腫瘤壞死因子，以及炎癥細胞形成后分泌各種炎癥因子，骨骼重建過程中溶骨細胞，破骨細胞分泌生長因子等，這些都形成了癌癥微環境[9-11]。這些因子和腫瘤的壓迫、壞死、缺血不斷刺激神經末梢，引起初級傳入神經元興奮性升高，導致外周敏化（peripheral sensitization）[12]。胡計嬅[13]等在研究中指出：外周敏化可使大量初級傳入神經元遞質釋放，遞質作用于脊髓背角神經元上相應受體，通過多種細胞信號傳導途徑作用于下游底物環磷酸腺苷（cAMP）反應元件結合蛋白CREB,CREB發生磷酸化后被激活，促使疼痛相關基因轉錄。CREB通路的功能改變是慢性疼痛形成及維持的機制[14]。因此pCREB在神經損傷后在中樞和外周敏化的過程中起了重要的作用。

圖2 脊髓背角pCREB免疫組化染色 (SABC法，×100倍)。

HPPE編碼的是人前腦啡肽，在其翻譯的過程中經不同的蛋白酶降解后形成兩個內源性活性阿片肽：腦內甲硫氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽。兩種阿片肽都參與了機體對疼痛信號調控，但它們并不進入細胞，而是只與神經細胞膜上的δ和μ阿片受體結合，改變痛覺傳入纖維（Aδ和C纖維）對疼痛刺激信號的反應性，產生鎮痛作用[15]。Atchison等[16]人的研究得出：大鼠腦室應用微量（200ng）腦啡肽就可以產生明顯的鎮痛效應，大鼠椎管內大劑量（10mg)應用腦啡肽也無明顯的呼吸循環功能障礙，證明其安全系數很高。蛛網膜下腔移植HPPE修飾細胞可以有效改善神經性疼痛，其鎮痛效應通過阿片受體介導[17]。

血腦屏障能控制進入中樞神經系統的物質，尤其對水溶性化合物通透性很低，使免疫調節分子及免疫活性細胞等不能通過，難以發生免疫應答[18]。蛛網膜下腔的免疫功能相比其他組織對外源細胞的免疫排斥要弱。鑒于此，本課題組前期實驗用人來源的HEK293細胞作為工具細胞，通過構建含有人前腦啡肽原基因（HPPE）的慢病毒載體，經過包裝后，感染，篩選出穩定表達該基因的HEK293細胞。將該細胞注射到大鼠蛛網膜下腔觀察其對大鼠骨癌痛的影響。遠期目標是將該細胞注入到骨癌痛病人的蛛網膜下腔觀察能否產生滿意的骨癌痛鎮痛效果。

本實驗結果顯示鞘內注射HH細胞后，改變了骨癌痛大鼠行為學并降低了慢性疼痛CREB傳導通路中脊髓背角pCREB的表達。說明鞘內注射該細胞后，在癌痛大鼠蛛網膜下腔存活且表達了少量的人前腦啡肽，對骨癌痛起到了一定鎮痛作用，且鎮痛效果可以被納洛酮拮抗。實驗過程中也發現雖然大鼠PWL增加，但pCREB表達減少程度并不明顯，說明目的基因表達不是十分理想。原因可能是：雖然血腦屏障對免疫調節分子和免疫活性細胞通透性低,但在病理狀態下[19]，處在骨癌疼痛當中的大鼠血腦屏障有可能出現通透性增高；或可能在行蛛網膜下腔穿刺置管時，將大鼠血液帶入蛛網膜下腔，而血液中存在相應的免疫分子，導致外源細胞被免疫。因此，該細胞能否長期存活并持續分泌鎮痛物質，仍需進一步研究。

另外，利用攜帶HEEP的慢病毒載體，包裝后，收集假病毒顆粒直接注射大鼠蛛網膜下腔，使其感染大鼠細胞，使目的基因整合到大鼠細胞并穩定表達HEEP，觀察是否能產生持續的骨癌鎮痛作用，這也是本課題下一步的研究目標。

綜上所述，大鼠慢性骨癌痛可導致其熱痛閾值降低，脊髓背角pCREB表達增加，而通過鞘內注射HPPE基因修飾的HEK293細胞后，可使大鼠熱痛閾值提高，脊髓背角pCREB表達降低，表明該重組細胞對大鼠骨癌痛有鎮痛效果，其鎮痛機制可能與抑制pCREB的表達有關。

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