人免疫球蛋白G含量檢測方法的研究進展

李 虎，臧恒昌，張 惠

(1.山東大學藥學院，山東 濟南 250012;2.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安 271000;3.國家糖工程技術研究中心，山東 濟南 250012)

免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)是人體含量最多的免疫球蛋白，占總血清免疫球蛋白的70% ～80%左右，相對分子質量為150 kD，是再次抗體應答中所產生的主要免疫球蛋白。成人血清中IgG含量約為7.0～16.6 g·L－1，人血清中的IgG主要為單體，包括四個亞類，其中IgG1占60% ～70%，IgG2占15～20%，IgG3占5% ～10%，IgG4占1～7%，不同亞類其重鏈的抗原性不同。IgG是機體抗感染免疫的主力抗體，其在體液中含量的高低往往作為慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的參考值，因此測定人體血清中IgG含量可對許多疾病的早期診斷提供依據。通過分離純化健康人血漿可得到較純的IgG制劑，如靜注人免疫球蛋白等。靜注人免疫球蛋白在臨床上用于治療多種免疫球蛋白缺乏癥和自身免疫性疾病，如X聯鎖低免疫球蛋白血癥、川崎病、特發性血小板減少性紫癜等［1］，準確測定靜注人免疫球蛋白中IgG的含量對其質量控制具有重要意義。目前測定IgG含量的方法有多種，按照其基本原理的不同可大體分為:免疫學方法、色譜分析法、生物傳感器技術及共振散射法。本文對各種方法的原理及其特點作以下綜述。

1 免疫學方法

1.1 免疫擴散法 免疫擴散法是早期檢測人IgG含量的常用方法，其原理為在一定條件下，人IgG與相應的抗體血清在凝膠中產生的沉淀環的大小與相應的抗原含量成正比。一般操作是將抗人IgG血清均勻混合于液態的瓊脂或瓊脂糖膠內，打孔，加樣，37℃孵育24 h，用游標卡尺測定擴散環的直徑，代入以不同濃度IgG標準品同法操作構建的回歸方程中，計算出待測樣品的IgG含量。這種方法操作簡便，無需儀器，成本較低，選擇性強，靈敏度較高，檢出量一般為10～20 mg·L－1。但其準確度受擴散環的清晰度及測量誤差影響較大，實驗時間長(24 h以上)，影響因素較多。

1.2 免疫比濁法 免疫比濁法于20世紀70年代由Ritcltic C首次提出，發展至今已成為臨床檢測人血清IgG的主要方法。其原理為IgG與相應的抗體在適宜的液相中特異性結合，形成可溶性的抗原抗體復合物，在促聚劑(如聚乙二醇等)的作用下抗原抗體復合物自溶液中析出，形成微粒，使反應液出現濁度。當抗體濃度固定時，反應液的濁度隨著檢樣中抗原量的增加而增加，與一系列標準品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。免疫比濁法按照檢測原理不同可分為以下三種:免疫透射比濁法、免疫散射比濁法和免疫膠乳比濁法。

散射比濁法與透射比濁法比較，兩者檢測結果的偏差隨樣品IgG濃度的升高而增大。李多孚等［2］利用這兩種方法檢測不同IgG濃度的人血清，發現當IgG濃度高于35 g·L－1時，相對誤差可達10%以上。散射比濁法靈敏度和準確度都要優于透射比濁法，但散射比濁法因其所需儀器及試劑價格較高，使得實驗成本較高;而免疫乳膠比濁法由于使用乳膠顆粒作為載體，增大了濁度粒子體積，所以具有較高的檢測靈敏度，可用于檢測IgG含量較低的樣品。

1.3 紫外－可見分光光度法 紫外－可見分光光度法是《中國藥典》2005年版中檢測靜注人免疫球蛋白類人IgG含量的測定方法，適用于檢測IgG純度較高的樣品。此方法的原理為在適當的離子強度、溫度、pH條件下，IgG與相應的抗體特異性結合，形成抗原抗體復合物，根據供試品溶液在340 nm處的吸光度與同法處理的標準品系列對照，求出其中人IgG的含量［3］。該方法線性關系較好，穩定性與準確性較高，且操作簡便易行。此法亦可應用于其他非人源性IgG的測定，蔣衛等［4］利用此方法定量測定凍干的豬血清中IgG含量，取得了良好效果。

1.4 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是免疫反應和酶催化顯色反應相結合的一種免疫診斷技術?；诖思夹g制成的ELISA試劑盒被廣泛應用于各類臨床免疫學檢測。ELISA試劑盒是將有免疫活性的抗原或抗體結合在固體載體上(一般為塑膠孔盤)上，使待測物與之發生免疫反應，配合酶催化的顯色反應可顯示目標物是否存在，在一定條件下顯色深淺與待測物中抗原或抗體的量成正比。根據待測樣品與鍵合機制的不同，ELISA可設計出各種不同類型的檢測方式，主要以夾心法(Sandwich)、間接法(Indirect)以及競爭法(Competitive)三種為主。夾心法分別以兩種抗體對樣品中的抗原進行兩次特異性識別，因此選擇性較高，一般應用于定量檢測各種蛋白質等大分子抗原。間接法一般用于檢測抗體，需要以高純度的抗原來提高選擇性。競爭法是一種較少用到的ELISA檢測方法，一般用于檢測小分子抗原。ELISA試劑盒靈敏度高，選擇性好，使用方便快速，適用于臨床大批量檢測。該方法目前多應用于特異性IgG的檢測，以確診相應疾病。陳翊［5］等以重組 SARS冠狀病毒結構蛋白作為抗原建立的ELISA檢測方法有較高的特異性和靈敏度，適用于SARS的輔助診斷。

2 色譜分析法

高效親和色譜(high－performance affinity chromatography，HPAC)結合了高效液相色譜與親和色譜兩種方法的特點，檢測靈敏度有大幅提高，而高度的親和力使得HPAC在所有色譜模式中具有最高的選擇性。HPAC是將可與人IgG特異、可逆結合的配基鍵合在凝膠載體上制成固定相填于層析柱中，待測物與磷酸鹽緩沖液流過層析柱時，其中的人IgG與固定相上的配基發生抗原－抗體結合反應而停留在柱上，其他物質則通過色譜柱，然后再用甘氨酸－鹽酸鹽緩沖液作為淋洗液將柱上的人IgG洗脫下來，進入紫外檢測器，可測得樣品中人IgG的含量。王淼［6］等用HPAC法測定靜注人免疫球蛋白中IgG含量，結果表明IgG濃度在0.25～20 mg·mL－1范圍內與峰面積呈良好的相關性(r=0.9999)。此方法檢測人IgG重現性好，選擇性高，樣品不需做預處理，操作簡便快速，一般在幾分鐘至幾十分鐘可完成檢測。但是由于親和層析柱價格昂貴，壽命較短，使得實驗成本較高，不適用于大批量檢測，探尋廉價易得的固定相或者延長柱壽命可使該方法得到更好普及。

目前親和層析柱較為常用的載體有瓊脂糖凝膠(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)［7］，常用的配基有蛋白A(Protein A)和蛋白G(Protein G)。蛋白A是金黃色葡萄球菌的細胞壁蛋白，僅與人IgG分子的Fc區具有很強的特異性親和作用。周冬梅等［8］建立了以蛋白A作為配基的親和膜色譜柱檢測人血清中IgG的方法，該方法檢測時間僅需0.5到 5 min，并具有良好的重現性(變異系數為3.6%)。蛋白G是鏈球菌細胞的細胞壁蛋白，其對非人源的IgG同樣具有很強的親和作用，可用于多種動物IgG的檢測，如兔、鼠、牛等。此外，親和層析的一種改良方法－灌注層析使用高度疏水的聚苯乙烯－二乙烯基苯作為柱填料，可允許有更高的流速，分析速度和靈敏度均有相應提高［9］。

3 生物傳感器技術

3.1 表面等離子共振技術 表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)生物傳感器是基于SPR技術分析生物分子相互作用的一種前沿分析技術，此方法可原位和動態測量各種生物分子之間的相互作用過程，廣泛應用于生命科學、醫學、藥物分析及食品等多個領域［10］。羅陽等［11］人利用SPR免疫傳感器芯片同步定量檢測尿液中多種微量蛋白，分析快速，結果準確，其中 IgG檢測靈敏度可達22 μg·L－1。SPR生物傳感器的優點是反應過程可實時監控，樣品無需標記，也可以無須純化各種生物組分。

3.2 電化學發光免疫分析 電化學發光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)是在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，其檢測原理為采用電化學發光劑三聯吡啶釕［Ru(bpy)3］2+標記抗體，通過抗原－抗體反應和磁珠分離技術，根據三聯吡啶釕在電極上發出的光強度對待測的抗體或抗原進行定量分析［12］。ECLIA在具體的分析中可分直接法、競爭法和雙抗夾心法。云雯等［13］利用雙抗體夾心法檢測人血清中IgG，檢出限可達20 μg·L－1。該方法具有靈敏度高，檢測速度快，可在線分析等優點。電極的構建和生物分子在電極表面的固定對傳感器的性能影響較大，與脂質體免疫分析技術相結合使該項技術有更高的靈敏度［14，15］，但由于試劑昂貴，不適于推廣普及。

4 共振瑞利散射法

瑞利散射是指半徑比光的波長小很多的微粒對入射光的散射，當瑞利散射與散射分子吸收帶接近或者相同時，散射強度大大提高，共振瑞利散射(resonance Rayleigh scattering，RRS)檢測技術就是近年來基于這一原理建立的一種新的分析技術。RRS可采用有機染料作為光散射探針分析蛋白質、核酸等生物大分子。有機染料分子在生物大分子表面，可形成較大的聚集體，使體系的RRS信號增強，據此測定痕量的蛋白質或核酸。黃克靖等［16］利用甲基藍作為熒光染色劑，建立了在低pH的BR(Britton－Robinson)緩沖溶液條件下測定人血清中IgG的方法，此方法靈敏度高，分析快速，而且具有較好的選擇性。

5 總結

綜上所述，應用免疫學的原理建立的方法是檢測人IgG含量的主流，基于免疫學原理檢測人IgG的自動生化分析儀以及酶聯免疫試劑盒分析簡便快速，通量高，是目前醫療機構檢測人IgG的主要方法;而色譜分析法操作簡便，自動化程度高，探尋廉價易得的耗材將使其有更廣闊的應用和發展空間;此外，由于生物傳感器技術有靈敏度高，樣品無需處理或僅需簡單處理，可在線實時分析，環境污染小等諸多優點，成為目前研究熱點，隨著這項技術的日趨成熟會被越來越多的應用到臨床人體液IgG檢測中。

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