眼鏡蛇神經毒素大鼠不同腦區給藥的鎮痛作用研究

劉啟萍，郝永龍

(山東中醫藥大學第二附屬醫院，山東 濟南 250001)

眼鏡蛇神經毒素肌肉注射給藥能明顯提高實驗大、小鼠的痛閾，具有鎮痛作用［1］。連續小劑量肌肉注射可使大鼠某些腦區的腦啡肽樣物質含量明顯升高，眼鏡蛇神經毒素的鎮痛作用不一定是直接作用于嗎啡受體而產生。至于眼鏡蛇神經毒素鎮痛機理的研究，只局限在中腦導水管部位注射微量眼鏡蛇神經毒素的研究，本文通過第三腦室、下丘腦和尾狀核都是與鎮痛有關的中樞部位，更進一步為研究眼鏡蛇神經毒素的鎮痛機理提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 試藥 純化的眼鏡蛇神經毒素(α－Cobrotoxin)由廣西醫科大學蛇毒研究所提供。電泳呈單一區帶，相對分子質量約7000 u(SDS法)，等電聚焦電泳測定PI為9.5。套管、戊巴比妥鈉、乙醚均由浙江中醫藥大學藥理教研室提供。

1.2 動物 SD大鼠80只，雄、雌各半，體重(220±30)g，均由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。

2 方法與結果

2.1 動物篩選 照藥理實驗方法學［2］大鼠熱刺激甩尾法要求篩選大鼠。選用2～10 s內引起甩尾反應的大鼠，將反應過激和反應遲鈍的大鼠剔除。

2.2 大鼠不同腦區內埋植套管 取經篩選的SD大鼠30只，隨機分為5組，每組6只，即對照組、第三腦室組、中腦導水管組、下丘腦組、尾狀核組。分別用質量濃度為3%戊巴比妥鈉30 mg·kg－1腹腔注射麻醉，固定于大鼠立體定位儀(江灣Ⅰ型C)上，用碘酒、75%消毒醫用酒精消毒皮膚，頭頂正中切開暴露顱骨，按大鼠腦立體定位圖譜［3］中腦導水管坐標A(前囟后1 mm)，L(正中線旁開 1 mm)，H(深度 5.5 mm);第三腦室坐標A(前囟后1.3 mm)，L(正中線旁開0 mm)，H(深度5 mm);下丘腦坐標A(前囟后1.8 mm)，L(正中線旁開 0.8 mm)，H(深度 6.4 mm);尾狀核坐標 A(前囟前 1.2 mm)，L(正中線旁開2 mm)，H(深度5 mm)下一側各腦區內埋管，將外徑1.2 mm，長度7 mm的不銹鋼套管埋植在靶位之上1 mm處，用慶大霉素注射液噴灑創面后，用牙托粉固定于顱骨表面。

2.3 各腦區內給藥 埋植套管7 d后，分別將各組大鼠用乙醚輕度麻醉置于大鼠腦立體定位儀上，用1 μL和50 μL微量注射器針頭插入套管，定位于各腦區。第三腦室為10 μL，其他不同腦區的每組大鼠分別注射1 mg·mL－1的α－Cobrotoxin生理鹽水溶液各0.5 μL，于2 min內勻速注射完畢，避免藥液外溢。對照組給藥方式同其它組，注射等量生理鹽水。

2.4 測定痛閾 參照藥理實驗方法學，在大鼠活動正常的情況下置大鼠于固定筒內，尾部暴露于外，將大鼠尾下部垂直浸入預熱(55±0.5)℃的恒溫水浴鍋中，浸入長度4 cm左右，以大鼠甩尾的潛伏期作為痛反應指標。給藥前間隔5 min測3次，取其平均值為基礎痛閾。給藥后每隔10 min測定一次，1 h后每30 min測定一次，共測3 h。所測值與基礎痛閾相比較。結果顯示:大鼠不同腦區定位注射神經毒素后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min用熱水浴甩尾法測定其痛閾，可以看出，下丘腦效果最好，10 min痛閾與生理鹽水組相比，即有顯著差異，30 min達高峰，并可持續180 min，痛閾最大提高213%;中腦導水管給藥后20 min達峰，痛閾最大提高167%(P＜0.01);第三腦室給藥后20 min達峰，痛閾最大提高142%(P＜0.01);尾狀核給藥后50 min達峰，痛閾最大提高135%(P＜0.01)。結果見圖1和表1。

表1 眼鏡蛇神經毒素大鼠不同腦區注射前、后的痛閾變化(n=6SD)

表1 眼鏡蛇神經毒素大鼠不同腦區注射前、后的痛閾變化(n=6SD)

注:與 NS組痛閾值比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

給藥后(t/s)in 150 min 180 min對照組(NS) 5.44±1.46 5.33±2.16 5.67±1.03 5.17±1.47 5.5±1.05 5.0±1.41 5.33±2.16 5.16±1.6組別給藥前(t/s)10 min 20 min 30 min 40 min 50 min 60 min 90 min 120 m 5.5±1.52 5.5±1.52 5.67±1.14中腦導水管組(2.5 μg·kg－1)4.94±0.67 9.67±0.94＊＊ 13.17±3.23＊＊ 12.17±2.73＊＊ 11.67±2.36＊＊ 10.83±1.86＊＊ 10.33±1.97＊＊ 10.0±1.15＊＊ 9.33±1.37＊＊ 8.33±2.13＊＊ 6.67±1.60*下丘腦組(2.5 μg·kg－1) 5.16±0.27 9.5±2.07＊＊ 14.17±3.31＊＊ 16.17±4.36＊＊ 13.67±2.88＊＊ 14.0±4.15＊＊ 13.17±4.36＊＊ 12.17±3.19＊＊ 10.5±3.02＊＊ 8.67±2.94＊＊ 7.83±1.72*第三腦室組(2.5 μg·kg－1)5.38±0.43 6.83±1.46* 13.0±2.30＊＊ 11.5±2.22＊＊ 10.5±2.14＊＊ 10.3±2.36＊＊ 9.5±2.75＊＊ 9.33±1.49＊＊ 9.17±2.11＊＊ 7.83±1.86* 6.83±1.07*尾狀核組(2.5 μg·kg－1) 5.23±0.83 6.33±0.94 7.16±1.07* 9.33±1.11＊＊ 11.33±1.79＊＊ 12.33±1.69＊＊ 11.16±1.57＊＊ 10.33±1.11＊＊ 9.5±0.96* 8.17±1.34* 7.5±0.95*

圖1 眼鏡蛇神經毒素不同腦區中樞性鎮痛作用

2.5 注射部位鑒定 每次實驗結束后將大鼠處死，解剖大腦確定插入的部位是否準確。然后取腦組織置于10%甲醛溶液中固定，做0.2～0.5 mm連續腦組織切片，根據注射針頭留下的痕跡準確確定其是否埋管準確。

3 討論

痛覺的傳遞系統包括三個主要部分，即外周感覺神經、脊髓到腦干和丘腦的神經元網絡以及丘腦和大腦皮質的相互聯系，包括丘腦、腦橋、中腦在內的皮質下中樞和大腦皮質構成了痛覺中樞。其中，丘腦的許多核團對疼痛有著顯著的調控作用，傳遞痛覺的脊髓丘腦束纖維就終止在丘腦的不同核團上。在這些核團中，含有對傷害性刺激的痛敏神經元，參與疼痛的興奮或抑制作用。同時，刺激下丘腦的前部、中部、后部和視上核可提高痛閾，產生明顯的鎮痛作用。因此，丘腦是疼痛傳遞和調制中非常重要的整合中樞［4，5］。

本實驗通過對大鼠下丘腦、中腦導水管周圍灰質、第三腦室和尾狀核四部位定位注射蛇神經毒素，結果表明這四個部位都具有較明顯的鎮痛作用，而下丘腦為鎮痛最佳部位。眼鏡蛇神經毒素的中樞作用部位為下丘腦、尾狀核、第三腦室、PAG、海馬和皮質等腦區。因本實驗中動物樣本數和腦區個數有限，關于注射眼鏡蛇神經毒素后，中樞較高含量的乙酰膽堿和內源性阿片肽的產生機制，及其M型膽堿受體作用仍有待深入研究。

［1］陳汝筑，吳秀榮.眼鏡蛇神經毒素的鎮痛作用［J］.中國藥理學通報，1988，4(2):113 －117.

［2］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.第2版.北京:人民衛生出版社，1991:90.

［3］Paxinos G，Waston C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates［M］.Second Edition.Sydney:Academic Press，1986:30.

［4］Helmchen C，Lindig M，Petersen D，et al.Disappearance of central thalamic pain syndrome after contralateral parietal lobe lesion:implications for therapeutic brain stimulation［J］.Pain，2002，98(3):325 －330.

［5］Desbois C，Villanueva L.The organization of lateral ventromedial thalamic connections in the rat:a link for the distribution of nociceptive signals to widespread cortical regions［J］.Neuroscience，2001，102(4):885 －898.