基于分子動力學模擬研究P53-DNA結合域單點突變對肽段的影響

許朝瑩

（山東師范大學物理與電子科學學院 山東 濟南 250014）

0 引言

P53作為最重要的抑癌基因之一，與癌癥的發生發展聯系緊密，大約50%的人類癌癥中存在著P53突變。P53定位于人類17p13.1染色體上，由11個外顯子和10個內含子組成，能編碼與核DNA結合的磷蛋白P53。人類P53蛋白由393 個氨基酸組成，有三個功能區:（1）N 端區域(1～94)；（2）中間疏水區域 (94～297，DNA Binding Domain，DBD)；（3）C 端區域(297～393)。DBD區域能直接與DNA結合，絕大多數腫瘤中檢查到的P53突變即發生在該區域中，由兩個反平行折疊片構成一個三明治樣的片層骨架結構。該區域有四個保守區域，分別記為Ⅱ-Ⅴ。Ⅳ(234-255)能直接和DNA結合，單獨存在時沒有嚴格的二級結構，呈無規則卷曲狀。迄今為止，對P53區域Ⅳ突變結構及生理功能缺乏深入系統的認識，對該肽段與腫瘤致病微觀機制的聯系尚不清楚。

P53蛋白殘基的點突變、缺失以及失活在癌癥的發生和發展過程中起著關鍵性的作用。Assaf Friedler等用NMR技術研究R249S突變對P53結構的影響，發現突變體的結構與野生態結構類似，但是β三明治片層骨架結構的柔性增加，DNA結合平面發生局部彎曲。Oded Suad等利用實驗檢測R249S、R249S/H168R和R249S/H168R/T123A突變對P53轉活功能的影響，發現R249S突變使DBD區域結構發生變化，與DNA、蛋白質之間的相互作用消失；R249S/H168R突變能穩定P53-DNA結構，能部分恢復P53的轉活功能；R249S/H168R/T123A突變進一步增強結構的穩定性。

盡管實驗生物學對P53突變作了大量研究和統計，對R249殘基突變影響P53結構也進行了一些研究。但是，在原子水平，P53蛋白及其突變區域的構象如何變化？與腫瘤致病微觀機制有何聯系？尚沒見到有關報道。本文利用分子動力學模擬方法，研究R249S突變對P53-DNA結構的影響。分別對野生型wtP53肽段和單點突變P53-R249S進行獨立的分子動力學模擬，每組模擬300ns。該研究為從分子層次認識腫瘤的致病機制和設計新的治癌藥物奠定理論基礎。

1 方法

P53蛋白的R249殘基位于DBD保守Ⅳ區域（殘基234-255），選取殘基230-258肽段作為研究對象。分別對wtP53肽段和單點突變P53-R249S肽段兩個體系進行分子動力學模擬，wtP53肽段的初始結構取自蛋白質結構數據庫（代碼為1tsr），R249S突變利用Swiss-pdbviewer軟件實現。

利用GROMOS軟件和43A1力場，分別對上述體系在NTP系綜下進行分子動力學模擬。帶電基團選用殘基在pH值為7.2下的質子化狀態，選用SPC水模型，選擇周期性大小合適的十二面體盒子，溶質同盒子邊緣最小間距設定為0.8nm。靜電作用力用PME計算，其庫倫力閾值定為0.9，范德華相互作用力的勢能距離閾值定為0.9。為使模擬體系保持電中性，wtP53肽段體系加入一個氯離子，P53-R249S體系呈現電中性，不加任何離子。能量優化后，約束溶質原子，進行300ps的約束動力學模擬，將體系溫度由50K平衡升到300K。使體系均保持在溫度300K、壓強1bar，采用弱耦合作用保持體系的溫度和壓強穩定，溫度和壓強的耦合時間常數均為0.1ps，模擬步長為2fs，進行300ns的自由動力學模擬，每2ps采集一次構象。

2 結果與討論

為深入探索生理環境條件不同殘基突變對P53肽段構象穩定性的影響，我們計算二組體系的自由能分布和聚類情況。

利用GROMACS的兩個程序g_covar和g_anaeig對模擬構象進行主成分分析，選取兩個最大主量PC1和PC2為反應坐標，根據構象分布，用二維直方圖法分別計算二個體系的自由能。自由能定義為-kTlnP(PC1,PC2)，其中，k和T分別為波爾茲曼常數和溫度，P（PC1,PC2）為兩個主量的聯合概率分布。在圖中，顏色越深，表明相應自由能越低、結構越穩定，構象落到該區域的概率就越大。不同殘基突變對結構有不同的影響。單點突變型P53-R249S肽段的自由能較低，而野生型P53肽段有一個相對穩定的中間態結構。

對體系進行構象聚類(Conformation clusters)分析，確定采樣構象的傾向。構象聚類基于構象之間骨架原子位置的根均方差(Root mean square deviation,RMSD)。在模擬最后100ns輸出的軌跡中，等間隔均勻選取1×104個構象作為分析對象，基于構象之間的根均方差進行聚類。聚類的標準是，如果一個構象同某個類里面的任一構象之間的根均方差小于0.1nm，那么這個構象就屬于該類。通過聚類發現，單點突變型P53-R249S肽段的中心構象有α螺旋結構，而野生型P53肽段只有β片結構。

3 結論

P53殘基突變是腫瘤病發的重要因素。為了研究R249S突變對結構的影響，本文選取P53殘基230-258肽段為對象，利用分子動力學模擬研究其突變對P53肽段的影響。采用GROMACS軟件包、43A1力場和充分含水模型，在生理條件下分別對肽段wtP53和單點突變P53-R249S進行300ns的獨立分子動力學模擬，研究R249S突變對結構的影響。結果表明:單點突變P53-R249S肽段自由能較低，無中間態，而野生型P53肽段有一個相對穩定的中間態。從原子水平上揭示單點突變P53-R249S肽段和wtP53肽段構象差異的動力學和熱力學特性，能更好地理解由P53殘基突變引起肝癌的微觀致病機制，為新藥物設計提供啟迪。

［1］Attardi,L.D.;Donehower,L.A.Mutat Res.2005,576(1-2),4.

［2］Soussi,T.Adv Cancer Res.2011,110,107.