HBV核苷類似物耐多藥的檢測分析

范曉寧

深圳南山區人民醫藥感染科，廣東深圳 518052

目前在我國，慢性乙型肝炎已經成為了一種臨床常見傳染性病癥。慢性乙型肝炎會引起肝衰竭、肝硬化以及原發性肝細胞癌等并發癥，給患者及其家屬帶來了嚴重的經濟損失和心理負擔，同時也給社會帶來一定的影響[1]。在現階段對慢性乙型肝炎進行治療的方法主要有抗病毒、抗纖維化、抗炎保肝、免疫調節以及對癥治療等幾種方式，在這眾多方法中抗病毒是對慢性乙型肝炎進行治療的重中之重。目前國家食品藥品監督管理局批準的可以用來對慢性乙型肝炎患者進行抗病毒治療的藥物主要有干擾素和核苷酸類似物這兩大類，干擾素類主要包括有普通IFNα-2b與聚乙二醇化IFNα-2a/2b;核苷(酸)類似物主要包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋以及替比夫定等。HBV是DNA病毒的一種，其自然史需要歷經逆轉錄的一個階段，然而逆轉錄酶對3,-5，外切酶相對比較缺乏，因此會使HBV很容易發生突變，所以在患者的體內其實病毒是以準種的形式存在[2]。在本次研究中，處于對HBV核苷類似物耐多藥的檢測進行分析的目的，我們抽取在過去一段時間在我院就診的患有慢性乙型肝炎發生多藥耐藥的患者病例的臨床治療資料進行分析。以下為本次研究的結果報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機抽取在2005～2011年這對時間內在我院就診慢性乙型肝炎患者發生多藥耐藥的病例18例，在所抽取的患者中有男性患者11例以及有女性患者7例，所有患者的年齡均在26～67歲之間，患者的平均年齡在44歲左右，以上所統計的患者的所有自然資料均不具有明顯的統計學差異，可以在分析中予以應用。

1.2 診斷標準

患者接受拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋以及替比夫定等單獨用藥或者是聯合用藥進行治療，并且存在治療失敗的情況，主要有發生了病毒學的突破或者是在進行治療的48周后HBV DNA依舊比檢測下限的患者要高，對依從性差等原因予以排除，自愿對詳細病史資料予以提供并且通過病毒耐藥檢測被診斷為是多藥耐藥[3]。

1.3 方法

對所抽取的18例患者中采用克隆測序法在每位患者體內隨機篩選60個克隆，對菌液聚合酶鏈反應以及經酶切進行鑒定結果為陽性的單克隆予以測序，并對患者出院3個月后進行隨訪，對患者的基因型以及耐藥基因變異的模式進行分析。

1.4 數據處理

在本次研究過程中所得到的所有相關數據，均采用SPSS 14.0統計學數據處理軟件進行處理分析，當P＜0.05時，我們認為數據之間有明顯的統計學差異。

2 結果

對這18例患者出院后3個月進行隨訪，11例男性患者中HBeAg均呈現為陽性結果，7例女性患者的HBeAg均呈現陰性。在這其中被診斷為乙肝后肝硬化和肝細胞癌的患者有5例，被診斷為乙肝后肝硬化的患者有5例，其他的8例患者均被診斷為慢性乙型肝炎。在這18例患者中的所有標本的巢式PCR擴增均呈現陽性結果，陰性對照沒有發生擴增。

3 討論

作為強且有效的抗HBV藥物,核昔(酸)類似物目前正面臨著HBV耐藥性所產生的嚴重挑戰。正如過去的研究結果所說的那樣,現階段的核昔(酸)類似物不會對細胞核內的cccDNA產生較好的效果,所以在停藥之后病毒的載量會出現反彈的現象,因此一般情況下應對患者進行較長時間的藥物治療。但是,用藥時間過長會對耐藥突變株的選擇產生影響。拉米夫定作為第一個獲得FDA批準的一個對HBV進行治療的藥物，其剛開始的耐藥率大約為20%左右,而后幾年時間里其耐藥率則呈現出不斷上升的趨勢，約上升到40%～70%左右,已經對長期使用拉米夫定產生了嚴重的威脅。到目前為止,任何已經上市或者是即將投入使用的核昔(酸)類似物均存在不同程度的耐藥現象[4]。對于一些結構相似，且具有作用機制的相同的藥物之間也會存在交叉耐藥性,這使原本就嚴峻的耐藥問題更加雪上加霜。但是值得安慰的是,阿德福韋作為第二個被FDA予以批準的抗HBV核昔(酸)類似物，其耐藥性不是十分的顯著,并且不會和拉米夫定產生嚴重的交叉性耐藥性；恩替卡韋作為第三個獲的批準的核苷類似物其耐藥性也相對比較輕微,但是還需要對其予以長期的臨床觀察。最近一段時間有文獻曾報道說阿德福韋或者是恩替卡韋是在拉米夫定產生耐藥的基礎上產生治療效果的,阿德福韋或恩替卡韋發生耐藥的比率要比沒有采用拉米夫定進行治療的患者多很多[5]。

HBV對核苷類似物的耐藥機制主要為以下幾點：HBV聚合酶所涉及的功能范圍主要為:末端蛋白，參與引發逆轉錄的過程；間隔蛋白、逆轉錄酶以及RNaseH。而逆轉錄酶的主要功能域有A-G這7個結構域[6]。目前對HBV聚合酶氨基酸序列進行編號采用的是曾經有相關學者所提出的分別對4個功能域進行編號的方法。以下的全部氨基酸序號都對這一編號方法予以了合理的例用。HBV逆轉錄酶C域203-206位氨基酸會形成具有保守性的YMDD基序，與一些其它的對RNA產生依賴的聚合酶相同,都是居于酶催化活性中心的一個主要的組成部分。雖然很難對HBV聚合酶進行純化從而獲得晶體的衍射結構,然而由于HBV以及HIV等的逆轉錄酶表現出比較明顯的序列同源性關系,目前已有很多研究小組根據HIV聚合酶對HBV聚合酶的三維結構模型予以了模擬構建。HBV聚合酶也具有“右手構象”的特點,同樣是由“拇指”、“掌”以及“手指”這三個亞功能域所組成的。在“掌”部，“手指”以及新加人的dNTP上其催化活性位點會與模板發生作用。“拇指”的主要作用就是對模板的定位和鏈的延伸進行參與。dNTP結合位點又被稱作是dNTP作結合口袋，存在于“掌”與“手指”之間[7]。

產生HBV耐藥性發生突變的主要原因是：任何對RNA產生依賴的聚合酶均不具有顯著的校正功能,也就是指3，-5，外切酶的活性。因此與依賴DNA的聚合酶相比其具有很高的錯配率。在HBV進行復制的周期過程中,對依賴RNA的聚合酶予以了兩次的使用:第一次是存在于宿主細胞的RNA聚合酶Ⅱ自cccDNA進行轉錄而得到前基因組RNA；第二次是HBV的逆轉錄酶通過前基因組RNA逆轉錄對基因組DNA進行合成。因此,盡管HBV屬于DNA的病毒,但是其發生突變的概率與其它的DNA病毒性比要高很多。HBV的突變率為在每個復制循環過程中，每個堿基會有10-4的機會，針對于每毫升的血清病毒載量為1012的病毒粒子的患者而言,HBV的復制率會達到每天1012病毒粒子。對這些理論數據進行分析得知，一個患者的體內所含的HBV每天幾乎會發生1000次點的突變。HBV的基因組相對較小，僅為3.2Kb左右，其所具有的ORF均會與其他的ORF發生重疊。因此，往往1個點的突變會導致多個基因產物也隨之發生變化[8]。所以，具有高突變率的HBV所引起的大部分的突變體對病毒來說都是有害的，但是只是一部分而已，還是會有一部分的突變是有利的，或者說在某種選擇壓力下是有意義的。相當大的一部分耐藥準種所具有的復制能力要比野生型的低很多，因此在不存在藥物選擇壓力的條件下，耐藥準種的含量相當的少。但在對核昔(酸)類似物予以應用以后，很快耐藥的HBV準種就將其它準種超過了從而占據了統治的地位。在停藥以后，該統治地位又會重新被野生型所取代。

綜上所述，作為抗HBV藥物核昔(酸)類似物具有一定的治療效果，它們仍將在一定時期內成為對HBV感染進行治療的一個首選藥物。由于人們已經比較深入的了解了抗HBV核昔(酸)類藥在臨床的應用過程中所產生的耐藥性的機制與規律，也許能夠通過對不同患者的HBV基因型以及表型進行監測從而制定出比較獨特的抗病毒的治療方案，進而使核昔(酸)類藥所具有的抗HBV治療作用能夠得到更好地發揮。

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