非血體液的γ－干擾素釋放檢測對結核感染的診斷價值

魏 娟綜述，汪芳裕審校

(本文編輯:張仲書)

隨著經濟水平提高，衛生條件改善，我國結核病的發病率有所下降，但結核感染的臨床表現也越來越不典型，為臨床診治帶來困難。對于接種過卡介苗、非結核桿菌感染、免疫缺陷人群，結核皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)的臨床診斷能力有限;對于潛在結核感染及細菌培養陰性的活動性結核患者來說，也無檢測的“金標準”，臨床上確診結核桿菌感染也比較困難，因此需要敏感性、特異性更佳的新診斷方法。

1 γ－干擾素釋放檢測(interferon gamma release assays，IGRAs)

1.1 IGRAs的定義 2001年美國食品藥品管理局(FDA)［1］將 IGRAs的第一代 Quanti FERON 結核檢測試驗(Quanti FERON－TB test，QFT)作為結核感染的診斷方法之一，在這之前僅有結核皮膚試驗廣泛地作為結核感染診斷的免疫試驗。在發達國家，外周血IGRAs被應用于結核感染診斷中，但外周血IGRAs尚不能鑒別潛在性與活動性結核感染。有報道在活動性肺結核患者中，T細胞同源擴散能被招募至感染部位［2］，因此通過酶聯免疫斑點試驗(enzymelinked immunospotassay，ELISPOT) 的方法，對感染局部的效應T細胞進行計數，在提高活動性肺結核診斷的特異性方面優于外周血。目前國內外針對結核感染局部的非血性體液進行的IGRAs研究，可能有助于提高結核感染診斷的敏感性及特異性。

1.2 IGRAs的分類 γ－干擾素 (IFN－γ)在調節細胞介導的免疫反應中起重要作用，故IGRAs通過檢測結核特異抗原誘導T細胞釋放IFN－γ來評估結核感染。第一代 IGRAs［3］是 Quanti FERON－結核試驗(Quanti FERON－TB test，QFT)，2001年由 FDA 允許作為診斷結核感染的方法之一，這是利用酶聯免疫法(ELISA)檢測由結核純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)刺激所產生的 IFN－γ的量。第二代 IGRAs［4］是 QFT 膠體金試驗(QuantiFERON－TB gold test，QFT－G)，利用結核特異性抗原即早期分泌的抗 原 靶 點 6(early secretory antigenic target－6，ESAT－6)和培養濾過蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP－10)刺激 IFN－γ 釋放的檢測。2007年第三代IGRAs誕生［5］，即QFT膠體金試管內試驗(Quanti FERON－TB gold in－tube test，QFT－GIT)，將預置有肝素、葡萄糖、植物素的試管加入混有試劑的外周血，并與結核特異抗原孵育，判斷對結核特異抗原的反應。2008年7月，FDA 認定第四代 IGRAs［5］，即結核感染T細胞酶聯免疫斑點法(T－ELISPOT tuberculosis，T－SPOT.TB)，實驗通過結核特異抗原即 ESAT－6和 CFP－10和外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)共同孵育，通過ELISPOT檢測分泌IFN－γ的細胞數來評估結核感染，其中每個斑點代表一個與相應抗原反應的T淋巴細胞。

1.3 外周血IGRAs診斷結核感染的價值評價 有研究［6］表明在培養陽性的活動性結核感染人群中，評價 QFT－GIT的陽性和陰性人數，其敏感性為81%。有研究［7－9］表明在培養陽性的活動性結核感染人群中，評價T－SPOT.TB的陽性以及陰性人數，其敏感性為91%。在比較T－SPOT.TB和TST試驗的敏感性研究中，T－SPOT.TB敏感性是90%，TST敏感性是89%。研究表明［7，11］在不可能感染結核的人群中，QFT－GIT特異性是99%，TST特異性是85%，TST 的特異性明顯比 QFT－GIT 和 T－SPOT.TB低，TST假陽性的結果，可能因卡介苗(Bacillus Calmette－Guerin，BCG)接種或暴露于非結核菌所致。

目前研究發現，無論是 TST，還是外周血的IGRAs，都不能準確地鑒別潛在結核感染、活動性感染以及抗癆治療后的感染。急性感染期間，有活性的T細胞主要積聚在炎癥反應局部以對抗感染，故外周血中的效應T細胞所占比例較少，研究炎癥局部的效應T細胞的數量對診斷活動性結核疾病可能更有意義。

2 非血體液的IGRAs診斷結核的價值

2.1 胸腔積液和支氣管肺泡灌洗液 Wilkinson等［12］將10例結核患者的結核性胸腔積液濃縮后，測出其中T細胞比外周血的高15倍(標準差為6倍)，同時行體外T－SPOT.TB分析，結果提示胸腔積液中ESAT－6抗原特異的T細胞數量明顯高于外周血，可為結核性胸膜炎診斷提供新方法。2006年某個案報道［13］一名64歲德國老年女性，既往有克羅恩病史，近期應用了他克莫司、氫化可的松、驍悉、英夫利昔等免疫抑制藥物，因胸腔積液就診，結核菌培養陰性。胸腔積液以及肺泡灌洗液、胸膜活檢、胸腔鏡活檢均未檢出抗酸桿菌。僅在胸膜病理活檢提示干酪樣肉芽腫，對外周血以及胸腔積液行T－SPOT.TB檢測，發現每250 000 PBMCs中含有104個ESAT－6特異T細胞，39個CFP－10特異T細胞;肺泡灌洗液中每250 000細胞中含178個ESAT－6特異T細胞，63個CFP－10特異T細胞，明顯高于外周血，經胸膜組織活檢的結核特異PCR證實了結核感染，經2周的抗癆治療后患者胸腔積液消失。說明即使患者在可能有免疫抑制的情況下，T－SPOT.TB對診斷活動性結核性胸膜炎也著重要作用，尤其是感染局部，對胸腔積液細胞的敏感性優于外周血2009年有研究［14］也發現肺結核感染患者肺泡灌洗液含有一定量的結核抗原特異性T反應細胞。Jafari等［10］對37例疑似肺結核患者進行研究，其中12例為痰涂片抗酸桿菌陰性的肺結核患者，25例為非肺結核患者。在12例肺結核患者中，每200 000 PBMCs中含有17 個 ESAT－6 特異 T 細胞，24.5 個 CFP－10 特異T細胞，在肺泡灌洗液中每200 000 PBMCs中含有含有37.5個 ESAT－6 特異 T 細胞，49.5 個 CFP－10特異T細胞;在對照組即非肺結核組中，每200 000 PBMCs中含有1個 ESAT－6特異 T細胞，1個 CFP－10特異T細胞，而在對照組的肺泡灌洗液中無活性細胞(P＜0.01)。此研究表明了，痰涂片抗酸桿菌陰性的肺結核患者，通過肺泡灌洗液中特異細胞的鑒定有助于準確診斷。2007年歐洲結核聯合機構組織了由4個研究中心參與的研究［15］，即選取20例具有臨床表現或影像學檢查懷疑的結核性胸膜炎患者為研究組，21例非結核所致的胸腔積液患者為對照組，對患者的 PBMCs及胸腔積液單核細胞(pleural effusionmononuclear cells，PEMCs)分別進行T－SPOT.TB檢查。研究組中有18例 PBMCs的 TSPOT.TB陽性，占 90%;而有 19例 PEMCs的 TSPOT.TB陽性，占95%。在對照組中有7例PBMCs的T－SPOT.TB檢測陽性，占33%，而有5例PEMCs T－SPOT.TB 陽性，占 23%。PEMCs 的 T－SPOT.TB對于診斷活動性結核性胸膜炎的敏感性以及特異性分別是95%和76%，皆明顯優于外周血。PEMCs中結核感染特異性細胞的計數在臨床上簡易可行，更有利于結核性胸膜炎的快速而準確的診斷。Dheda等［16］以91例疑似結核感染的南非患者為研究對象，利用 ESAT－6、CFP－10、血凝素作為刺激抗原，通過 T－SPOT.TB、QFT－GIT 的方法進行比較，結果提示，在明確診斷肺結核患者中T－SPOT.TB陽性率(58%)比痰涂法(29%)更高，血凝素和PPD刺激反應作用較差，說明肺泡灌洗液細胞在結核特異抗原刺激下的IFN－γ反應有助于快速診斷結核。

但同時有結果相悖的報道，2008年Chegou等［17］選取66例不明原因胸腔積液患者，抽取患者外周血和胸腔積液的樣本進行游離IFN－γ水平檢測和QFT－GIT，比較兩者在結核診斷中的價值，結果提示，胸腔積液中游離IFN－γ水平是診斷結核性胸膜炎的更為準確的生物標記，優于QFT－GIT。2009年Dheda等［18］選取南非78例疑似結核性胸膜炎所致的胸腔積液病例為研究對象，結果提示未行刺激的胸腔積液中IFN－γ水平的檢測對于結核感染的診斷更加精確，通過檢測特異性抗原刺激局部的T細胞IFN－γ分泌并不能增加其診斷價值。2009年Hooper等［19］綜述既往研究，認為IGRAs比直接檢測胸腔積液中特征性的標記物更加復雜和昂貴，檢測的結果多有波動，不穩定，且不能排除活動性結核感染。2010年Krenke等［20］認為，目前在活動性結核性胸膜炎的診斷中，無肯定的證據證明IGRAs診斷價值優于胸腔積液中腺苷脫氨酶和IFN－γ水平檢測。

2.2 腦膜炎腦脊液的IGRAs 結核性腦膜炎患者中軟腦膜是結核感染的局部炎癥部位，其腦脊液可通過穿刺途徑獲得，故通過對腦脊液的分析，診斷結核感染是可行的。有報道［21］稱11例疑似結核性腦膜炎患者中，9例腦脊液的T－SPOT.TB具有很高的T細胞反應。以上研究提示腦脊液T－SPOT.TB具有較高的敏感性。2008年Luca等［22］研究比較了外周血和腦脊液的QTF在診斷結核性腦膜炎中價值，發現全血中QTF的敏感性為78.57%，QTF在腦脊液中的特異性高于血，陽性預測率超過90%。腦脊液的QTF比腦脊液細菌培養速度更快，敏感性更高，是診斷結核性腦膜炎的好方法。2008年Kim等［23］以37例中樞神經系統結核患者為研究對象，發現PBMCs的 T－SPOT.TB的敏感性、特異性分別為91%和63%，而腦脊液T－SPOT.TB的敏感性和特異性均為75%。此報道提示腦脊液T－SPOT.TB在診斷結核性腦膜炎中具有很高的特異性，PBMCs和腦脊液T－SPOT.TB檢查能提高中樞神經系統結核感染的準確性。2010年Patel等［24］證明，利用腦脊液中單核細胞的結核特異抗原刺激的 T－SPOT.TB，在診斷結核感染方面具有快速準確的特點。但是 Méndez Echevarría 等［25］指出 QFT－GIT 在某個患有結核性腦膜炎的兒童的診斷上缺乏敏感性。

2.3 腹水的IGRAs 2009年我國協和醫院張麗帆等［26］報道，利用結核特異抗原刺激外周血、胸腹水、腦脊液的單核細胞，計數釋放IFN－γ特異性T細胞，發現腹水中斑點形成細胞數是外周血的31.9倍。與PBMCs的 T－SPOT.TB相比，腹水中的檢測可能更準確地診斷腹膜結核感染。Lorenz等［27］報道某20歲女性，因腹水、乏力、盜汗、低熱等癥狀入院，痰涂片抗酸桿菌陰性，腹水和糞便結核PCR陰性，而腹水和PBMCs的QFT－G陽性。腹膜活檢標本的細菌培養陽性和診斷性抗癆治療證實患者為結核性腹膜炎，說明了腹水的QFT－G對診斷結核性腹水有一定的診斷價值。

3 結語

結核桿菌培養周期長，盡管國內有報道［28］經皮穿刺腹膜活檢結核明確診斷率為30.8%，但結核感染組織活檢標本收集仍有難度，且抗酸桿菌檢測陽性率低，結核的PCR檢測易污染、費用高，多種因素導致臨床上結核感染診斷困難。目前在國際上外周血的IGRAs已是診斷結核感染的常用方法。結核感染時，有活性的T細胞主要積聚在炎癥反應局部如胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液、腹水、腦脊液、腸道灌洗液，這些標本較易獲得，故計數其中效應T細胞對診斷活動性結核疾病顯得更有意義，有利于準確診斷結核感染。但目前國內外針對非血性體液IGRAs研究樣本量偏小，代表性不強，其真正的診斷準確度尚無定論，且與外周血IGRAs比較，其陽性的界定點尚需要統一，試驗結果假陽性代表何意義尚不明了。故需要大樣本多中心的研究，試驗方法也應標準化、統一化，為迅速準確地診斷結核感染提供幫助。

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