反應(yīng)曲線在速率法檢測AST底物耗盡現(xiàn)象中的應(yīng)用

任崢 鄒翠美 夏春燕

酶活性檢測是臨床生化常規(guī)一個重要組成部分，全自動生化分析儀由于其高精密度和光柵的應(yīng)用，為用速率法準確檢測各種酶的活性提供了很好的保證。當標本中酶含量過高，此時就容易出現(xiàn)在檢測過程中酶的底物短時間內(nèi)消耗殆盡，即從開始讀點之前至反應(yīng)終點的吸光度反應(yīng)曲線的一段或整段為一平坦曲線，使得反應(yīng)吸光度變化近乎為零，其斜率不符合實際情況，所得反應(yīng)結(jié)果也與真實值不符，這種現(xiàn)象稱為底物耗盡［1］。此種情況下，檢驗者若只從檢驗結(jié)果分析往往會發(fā)出錯誤的報告，從而影響臨床診斷和治療。本文通過對16例AST高值標本進行原倍和稀釋5倍、10倍進行測定，再通過對反應(yīng)曲線的觀察分析，發(fā)現(xiàn)和解決底物耗盡現(xiàn)象問題。

資料與方法

1.檢測對象:16例AST高值標本。

2.檢測方法:將16例AST高值標本分為對照組和問題組，分別檢測其原倍及去離子水稀釋5倍、10倍標本的AST值，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。所有標本均測三次，取平均值。

3.統(tǒng)計學方法:將對照組及問題組各高值標本5倍稀釋結(jié)果與未稀釋結(jié)果，10倍稀釋結(jié)果分別與未稀釋結(jié)果和5倍稀釋結(jié)果進行多樣本比較的秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

對照組及問題組原倍和去離子水稀釋5倍及10倍檢測結(jié)果見表1，對照組1－8號標本原倍分別與5倍、10倍稀釋結(jié)果比較，5倍稀釋與10倍稀釋結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);問題組1－8號標本原倍分別與5倍、10倍稀釋結(jié)果進行比較，5倍稀釋與10倍稀釋結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，問題組樣本兩兩比較結(jié)果見表2。

表1 AST高值標本原倍及稀釋檢測結(jié)果(kruskal－wallis H檢驗)(單位U/L)

表2 問題組樣本兩兩比較秩和檢驗(Nemenyi檢驗)結(jié)果

討 論

在酶促反應(yīng)過程中，不是任何時期的反應(yīng)速率都和酶濃度成正比。當酶促反應(yīng)剛一開始，底物處于過量狀態(tài)，酶與底物開始結(jié)合，生成復合物(ES)，底物濃度開始下降，此時產(chǎn)物尚未形成。當復合物(ES)分解生成產(chǎn)物(P)，酶促反應(yīng)速度急聚上升，經(jīng)過很短的作用時間后，產(chǎn)物的生成量或底物的減少量與反應(yīng)時間成線性關(guān)系，反應(yīng)速度保持恒定不變，這一時期稱為零級反應(yīng)期。由于只有在零級反應(yīng)期，單位時間內(nèi)吸光度的變化值才與酶的活性成正比，當樣本中AST的活性超過檢測線性范圍時，底物在短時間內(nèi)被耗盡，零級反應(yīng)期很短，速率法檢測所設(shè)定的吸光度讀點完全不在零級反應(yīng)期，以致零級反應(yīng)期內(nèi)檢測不到吸光度的變化而出現(xiàn)低值甚至負值結(jié)果。

通過觀察1－16號標本反應(yīng)曲線發(fā)現(xiàn)，對照組1－8號標本不存在底物耗盡現(xiàn)象，其反應(yīng)曲線在加入試劑2后，所有反應(yīng)曲線為一下降直線，說明這一期間反應(yīng)速度保持恒定，吸光度變化值與酶濃度成正比，即△A/點(吸光度變化率)是一定值。問題組1－8號標本存在底物耗盡現(xiàn)象，其反應(yīng)曲線在加入試劑2后，其下降曲線都會出現(xiàn)長短不一的一段平坦曲線，這是由于在反應(yīng)過程中酶底物耗盡使得多個反應(yīng)點吸光度趨于一致，曲線產(chǎn)生一段平臺期，△A/點≈0，甚至可能是一負值，則計算出的結(jié)果不是真實值。

綜上所述，底物耗盡現(xiàn)象在速率法檢測酶活性時都有可能存在，每天通過觀察其反應(yīng)曲線，可以及時發(fā)現(xiàn)檢測中是否存在此現(xiàn)象，如有底物耗盡現(xiàn)象，可通過稀釋樣本重新檢測得以解決，這樣可以避免因錯誤結(jié)果而延誤對患者的診斷治療。

1 黃志偉.AST動力學法測定時底物耗盡現(xiàn)象淺析［J］.現(xiàn)代醫(yī)學儀器與應(yīng)用，2005，17(2):30 －32.