自家苗治療連城白鴨漿膜炎的效果研究

羅小華

（福建省連城縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，福建 連成 366200）

本文用當(dāng)?shù)伉唸?chǎng)分離的鴨疫里默氏菌株制備自家苗，對(duì)防治鴨傳染性漿膜炎的效果進(jìn)行了探討和研究，旨在為實(shí)際生產(chǎn)作指導(dǎo)。

1 細(xì)菌分離與鑒定

1.1 分離培養(yǎng) 選擇剛死亡且具有典型鴨傳染性漿膜炎病變的病死鴨，無(wú)菌采集肝組織，將采集的病料剁碎，除去結(jié)締組織和筋膜后稱重，加適量生理鹽水，用消毒好的組織勻漿機(jī)絞3～5min至勻漿狀。由于搗碎機(jī)高速運(yùn)轉(zhuǎn)，溫度上升很快，尤其是夏天溫度高時(shí)，容器中的病料很容易變質(zhì)而破壞病原的免疫原性，故夏天制苗時(shí)，在搗碎機(jī)中加入病料和生理鹽水時(shí)要用冷卻水冷卻。對(duì)于新采取的病料需反復(fù)凍融三次，將解凍的病料與生理鹽水按1kg：3500～4000mL的比例進(jìn)行稀釋，再用雙層無(wú)菌醫(yī)用紗布過濾，然后將濾液先后過一次八層和十二層的紗布。再取樣分別接種于普通培養(yǎng)基、馬丁肉湯、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板，分別作純培養(yǎng)。

1.2 形態(tài)觀察 將分離的10株細(xì)菌在馬丁肉湯中（37℃）作、24h純培養(yǎng)，再分別用革蘭氏染色和瑞氏染色進(jìn)行鑒定。

1.3 生化試驗(yàn) 分離菌經(jīng)純化后，用其48h馬丁肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行生化反應(yīng)測(cè)定，置37℃燭缸中觀察15 d。

1.4 血清學(xué)鑒定 將分離細(xì)菌接種在葡萄糖淀粉瓊脂平皿上培養(yǎng)24h，然后將每個(gè)平皿上的細(xì)菌懸浮于8.5%氯化鈉（質(zhì)量百分比）、0.02mol/L磷酸鹽、0.3%福爾馬林（體積百分比）溶液中（pH=7.0，1mL），再在100℃水浴鍋上加熱1 h，然后1 500 r/min離心30min，取上清液，與1型鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.5 藥敏試驗(yàn) 在巧克力瓊脂平板上采用藥敏片擴(kuò)散法進(jìn)行。在含5%～10%CO2的環(huán)境中37℃下培養(yǎng)24 h觀察，然后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.6 動(dòng)物發(fā)病實(shí)驗(yàn) 取10只健康雛鴨作動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，皮下注射培養(yǎng)菌液后觀察雛鴨有無(wú)發(fā)病癥狀。

2 分離鑒定結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng) 將病料接種于巧克力瓊脂平板上，經(jīng)37℃厭氧培養(yǎng)48h后，長(zhǎng)出了灰白色、半透明、微凸起的圓形菌落；在馬丁肉湯中呈現(xiàn)均勻混濁狀態(tài)；置于燭缸中的麥康凱瓊脂平板上未見有細(xì)菌生長(zhǎng)；在37℃恒溫培養(yǎng)的麥康凱平板上培養(yǎng)3d后，亦無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)；普通瓊脂平板上同樣無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.2 形態(tài)觀察 分離的10株細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，均為革蘭氏陰性小桿菌；經(jīng)瑞氏染色法染色鏡檢，可見7株細(xì)菌呈兩極濃染，符合鴨疫里默氏桿菌的染色特性。

2.3 生化試驗(yàn) 糖發(fā)酵試驗(yàn)：對(duì)甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖均不發(fā)酵；不還原硝酸鹽，MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)均為陰性；過氧化氫酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性。以上反應(yīng)均符合鴨疫里默氏桿菌的生化特性。

2.4 血清學(xué)鑒定 凝集試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)證實(shí)，與1型鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明7株瑞氏染色陽(yáng)性細(xì)菌株均為鴨疫里默氏桿菌血清1型。

2.5 藥敏試驗(yàn) 分離菌對(duì)氟甲砜霉素、甲哌利福霉素、氨芐青霉素、先鋒霉素、林可霉素高度敏感；對(duì)青霉素、呋喃唑酮和氯霉素中高度敏感；對(duì)慶大霉素、新霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素不敏感。

2.6 動(dòng)物發(fā)病實(shí)驗(yàn) 試驗(yàn)鴨接種病料后48h，雛鴨相繼發(fā)病，眼、鼻流出漿液性分泌物。糞便稀薄呈綠色，嗜眠、縮頸或嘴抵地面，腿軟弱，不愿走動(dòng)；瀕死前出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如痙攣、搖頭、點(diǎn)頭，背脖和兩腿伸張呈角弓反張。剖檢病死鴨，最明顯的病變是心包腔內(nèi)及肝表面有一層纖維素性滲出物；心外膜、氣囊壁混濁增厚，腹腔積水，有的脾臟腫大，表面有灰白色斑點(diǎn)。取典型病死鴨病料用瑞氏法染色，發(fā)現(xiàn)菌體兩端濃染，呈兩極染色特性。

通過以上分離鑒定，確定從可疑鴨疫里默氏桿菌病鴨中分離的菌株為鴨疫里默氏桿菌。

3 自家苗的制備與檢測(cè)

3.1 增菌培養(yǎng) 將純培養(yǎng)物接種于馬丁肉湯培養(yǎng)液，37℃振搖培養(yǎng)24h，取少量菌液作細(xì)菌計(jì)數(shù)，使?jié)舛冗_(dá)1010個(gè)/mL。

3.2 甲醛滅活 加入體積百分比為0.4%的甲醛溶液，置37℃下滅活48h，滅活期間，每4～6h搖動(dòng)一次，搖動(dòng)時(shí)間約為半小時(shí)。滅活完畢后，按1500 IU/mL比例加入雙抗（青霉素和鏈霉素），還要加一定量的黃芪多糖，以增加抗體的生成。搖勻后進(jìn)行無(wú)菌分裝，置4℃下保存待用。

3.3 無(wú)菌檢驗(yàn) 取滅活后的菌液接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，如果無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)說(shuō)明甲醛滅活完全，無(wú)菌檢驗(yàn)合格；反之則自家苗制備失敗。

3.4 安全性檢驗(yàn) 取10只健康雛鴨，頸部皮下注射1mL菌液，連續(xù)觀察14 d，如果雛鴨無(wú)外觀癥狀，也無(wú)病理變化，則表示自家苗安全。

3.5 效力檢驗(yàn) 取20只健康雛鴨，其中只對(duì)10只雛鴨注射疫苗：將疫苗回溫且徹底搖勻后于頸部皮下或肌肉注射（0.2mL/只），另外10只作為對(duì)照組。注射前要對(duì)注射針具徹底消毒，注射時(shí)要勤換針頭。注射完疫苗后，有的鴨群略顯安靜，采食飲水略有下降，這均屬正常的機(jī)體反應(yīng)，一般1～2d即可完全恢復(fù)。14d后對(duì)兩組雛鴨分別注射未滅活的鴨疫里默氏桿菌，然后進(jìn)行細(xì)致觀察。分開飼養(yǎng)，以免交叉感染。共分4個(gè)批次進(jìn)行效力檢驗(yàn)試驗(yàn)，每次均分為試驗(yàn)組和對(duì)照組兩組，免疫程序和劑量均相同。

4 自家苗的制備與檢測(cè)結(jié)果

4.1 純培養(yǎng)物作增菌培養(yǎng) 在馬丁肉湯培養(yǎng)液中經(jīng)37℃振搖培養(yǎng)24 h后，取少量菌液作細(xì)菌計(jì)數(shù)，結(jié)果細(xì)菌濃度達(dá)了3.2×1010個(gè)/mL。

4.2 無(wú)菌檢驗(yàn) 經(jīng)普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37℃培養(yǎng)24 h后，無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明甲醛滅活完全，無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

4.3 安全性檢驗(yàn) 連續(xù)觀察14d后，雛鴨無(wú)外觀癥狀，剖檢也未發(fā)現(xiàn)病理變化，說(shuō)明粗制疫苗菌液是安全的。

4.4 效力檢驗(yàn) 經(jīng)觀察，對(duì)照組雛鴨過夜后即有發(fā)病者出現(xiàn)，病初表現(xiàn)為眼流漿液性或黏性分泌物，常使眼周圍羽毛粘連或脫落；鼻孔流出漿液或黏液性分泌物，有時(shí)分泌物干涸，堵塞鼻孔；有輕度咳嗽和打噴嚏；糞便稀薄呈綠色或黃綠色；嗜睡，縮頸或嘴抵地面，腿軟，不愿走動(dòng)、步態(tài)蹣跚；瀕死前出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如痙攣、背脖和兩腿伸直呈角弓反張狀，尾部搖擺等，不久抽搐而死，病程一般2～3d。經(jīng)剖檢證實(shí)為注射的鴨疫里默氏桿菌所引起，而試驗(yàn)組（接種疫苗組）連續(xù)觀察14 d后，無(wú)病例出現(xiàn)。說(shuō)明所制自家疫苗對(duì)鴨疫里默氏桿菌病有保護(hù)作用。

經(jīng)過對(duì)4批共計(jì)80只雛鴨的防治試驗(yàn)表明：使用以上方法制備的自家苗對(duì)鴨傳染性漿膜炎有明顯的防治效果。在鴨群發(fā)病時(shí)，使用疫苗1周后發(fā)病明顯減少，10～15 d病癥狀完全消除，未見復(fù)發(fā)情況。同時(shí)，用自家苗對(duì)未發(fā)病鴨群免疫接種也能起到良好的預(yù)防效果，未見該病發(fā)生。

5 結(jié)論

筆者用自制的疫苗對(duì)發(fā)生鴨漿膜炎的鴨群進(jìn)行緊急注射能很快控制疫情；對(duì)未發(fā)病的鴨群提前注射又 起到了有效預(yù)防控制的作用。因此該自家苗是防治鴨傳染性漿膜炎的一種有效疫苗。

雖然自家苗具有免疫防治作用，但由于它屬于生物性產(chǎn)品，所以要絕對(duì)注意其生物安全性。首先，目前沒有什么辦法去測(cè)定自定苗中具體的病原含量，這是一種運(yùn)用實(shí)踐來(lái)檢驗(yàn)效果與質(zhì)量的治療方法。其次，自家苗本身就是滅活苗，無(wú)論細(xì)菌還是病毒等大多已經(jīng)被殺死，而且采集的有可能是幾種病混合感染的病料，所以病料成分及結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，產(chǎn)生抗原的蛋白質(zhì)種類也多。最后，雖然自家苗可以用，但是前提是發(fā)病比較厲害的情況下采用，不要?jiǎng)虞m就用自家苗，那樣風(fēng)險(xiǎn)會(huì)很大。

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