食品微生物快速檢測技術研究進展

鄒小龍，姜川，郝大偉

（麗水市質(zhì)量技術監(jiān)督檢測院，浙江麗水323000）

食品微生物快速檢測技術研究進展

鄒小龍，姜川，郝大偉

（麗水市質(zhì)量技術監(jiān)督檢測院，浙江麗水323000）

快速檢測食品中微生物的方法在食品衛(wèi)生檢驗方面起著越來越重要的作用，最終將達到預防腸道傳染病和食物中毒的發(fā)生的目的。快速方法包括電化學法、細菌直接計數(shù)法、免疫學技術、PCR法、全自動微生物分析系統(tǒng)等。對上述各種快速檢測食品中微生物的方法作一綜述。

快速檢測；食品；微生物

Abstract:The rapid detection of microorganisms in food testing methods in food hygiene plays an increasingly important role,will eventually be able to prevent the occurrence of food-borne diseases and food poisoning purposes.Rapid methods include electrochemical method,bacterial direct counting method,immunological techniques,PCR method,fully automated microbial analysis system.In this paper,the above-mentioned rapid detection method of micro-organisms in food are reviewed.

Key words：rapid detection;food;microbial

20世紀90年代末至今，全球食品安全惡性事件頻發(fā)，食源性疾病已經(jīng)成為影響公共健康的重要因素。據(jù)WHO統(tǒng)計，發(fā)達國家每年約有三分之一的人感染食源性疾病，而且在一些發(fā)展中國家，食源性疾病往往是致人非正常死亡的主要原因。根據(jù)不同的資料來源，全世界每年有220萬～1000萬人因患食源性疾病而喪生。食源性疾病主要是由微生物和化學藥物所引起的，其中微生物引起的食源性疾病占具一半以上的比例。食品中的微生物污染成為食品安全的首要問題。微生物污染存在在食品生產(chǎn)、加工、儲存、運輸、銷售、到食用的整個過程的每個環(huán)節(jié)中，對人體產(chǎn)生嚴重的危害。常規(guī)的檢驗大多通過培養(yǎng)基培養(yǎng)目標微生物，然后利用肉眼或放大鏡觀察計數(shù)的方式，來確定食品是否受到此微生物的污染。常規(guī)檢測手段由于步驟繁雜，判斷指標一般都需要肉眼觀察，因此檢測時間較長，少則2 d～3 d，多至數(shù)周，才能確定。這往往無法滿足現(xiàn)代化食品工業(yè)以及社會發(fā)展的食品安全快速檢測需求。如何快速、實時、現(xiàn)場的檢測食品微生物污染成為目前急需解決的技術問題。

鑒于食品工業(yè)對微生物快速檢測的需求，微生物快速檢測技術得到了迅速的發(fā)展。各種基于不同類型的新型快速檢測技術相繼出現(xiàn)。例如，利用培養(yǎng)基電化學性質(zhì)變化檢測微生物；基于流式細胞儀和固相細胞計數(shù)儀的細菌直接計數(shù)法；基于抗原抗體免疫學技術的快速檢測技術；基于聚合酶鏈式反應（PCR）的微生物快速檢測技術；傳統(tǒng)生化反應及微生物檢測技術與現(xiàn)代計算機技術相結合的集成化商品化快速分析系統(tǒng)等等。本文將對各類微生物快速檢測技術進行詳細闡述。

1 基于電化學原理的微生物快速檢測技術

電化學阻抗技術是指細菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖的過程中，會使培養(yǎng)基中的大分子電化學惰性物質(zhì)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等代謝為具有電活性的小分子物質(zhì)，如乳酸鹽、醋酸鹽等，這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基的導電性和氧化還原性，使培養(yǎng)基的電化學性質(zhì)發(fā)生變化。通過檢測培養(yǎng)基的在電極表面體現(xiàn)的電壓、電流、電阻抗等變化情況，即可判定細菌在培養(yǎng)基中的生長、繁殖特性。該法已用于食品中細菌總數(shù)、大腸桿菌、沙門氏菌、酵母菌、霉菌和支原體的檢測，具有高敏感性、特異性、快速反應性和高度重復性等優(yōu)點。

國外在此領域的研究工作開展相對較早。1979年T.Matsunaga首次實現(xiàn)了燃料電池型電極系統(tǒng)對培養(yǎng)液中細菌進行了快速測定。此系統(tǒng)由雙電極體系構成，每一電極均由鉑陽極和Ag2O2陰極復合而成，在參比電極陽極表面覆有纖維素透析膜，用于扣除基體電流對測定的干擾。檢測結果顯示，工作電極與參比電極電流之差與微生物濃度呈線性關系，響應時間為15 min，檢測限為 107cell/mL[1]。1982 年 Nishikawa將上述檢測系統(tǒng)加以改進。使用微孔濾膜富集微生物，使用2，6-二氯酚靛酚作為電子傳遞媒介，增大了響應電流，顯著的提高了檢測限，達到104cell/mL[2]。1984年T.matsunaga又開創(chuàng)了平面熱解石墨電極為工作電極的循環(huán)伏安法檢測微生物細胞。實現(xiàn)了幾種微生物細胞的識別，第一次提出可利用生物傳感器進行細胞種類的識別[3]。1988年G.Ramsay等首次利用伏安型細胞傳感器進行了菌數(shù)濃度的測定。以E.coli為試驗菌種，鐵氰化鉀為電子傳遞媒介，利用微機化極譜儀控制工作電極（Pt電極）電位在﹢400 mV（vs Ag/AgCl電極)，測量電流對的時間斜率，能夠?qū)崿F(xiàn)對生肉、牛奶、廢水中微生物濃度的監(jiān)測，響應時間小于1 min[4]。

國內(nèi)在基于電化學技術的微生物快速檢測技術研究雖然起步相對較晚，但是發(fā)展非常迅速，也取得了不少研究成果。1992年，許春向等利用電化學方法，分別研究了以2，6-二氯酚靛酚（DCIP）和4，4'-聯(lián)吡啶為電子傳遞體的伏安型微生物快速測定傳感器。研究表明，以2，6-二氯酚靛酚（DCIP）為電子傳遞體的微生物細胞傳感器可連續(xù)監(jiān)測啤酒發(fā)酵罐中酵母菌總數(shù)的燃料電池型細胞傳感器，響應時間為5 min，電極壽命大于150 d[5]。以一聯(lián)毗啶為電子傳遞體的微生物細胞傳感器不但能夠用于微生物的計數(shù)，同時能夠用于微生物細胞的識別。研究實現(xiàn)了對啤酒酵母菌、枯草桿菌和大腸桿菌的檢測。細胞識別傳感器除了可以識別一些微生物細胞、動物及人的淋巴細胞、粒細胞外，尚可識別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[6]。2001年，北京檢驗檢疫局的陳廣全等人實現(xiàn)了以改進的沙門氏菌選擇培養(yǎng)基四硫磺酸鹽煌綠增菌培養(yǎng)基（TTB）為培養(yǎng)基，以電化學阻抗技術為測量手段，通過在培養(yǎng)基中加入氧化三甲氨增加培養(yǎng)基的電阻抗變化靈敏度，連續(xù)檢測沙門氏菌代謝所引起培養(yǎng)基的電阻抗變化值，利用培養(yǎng)基電阻抗降低的百分比判定沙門氏菌的存在。經(jīng)與常規(guī)培養(yǎng)法進行比較，對加入食品中的21種已知沙門氏菌屬的檢測，電阻抗法19個為陽性，檢出率在90%以上，常規(guī)法檢出18個，檢測結果與常規(guī)培養(yǎng)法相一致，對于陰性結果能在48 h內(nèi)出具結果。結果表明電阻抗法能夠快速、可靠地檢測食品中的沙門氏菌[7]。2005年，西安電子科技大學的周永軍等也實現(xiàn)了以色素還原試驗法為基礎，通過添加適量的生物催化劑和離子激勵劑，實現(xiàn)一種能快速測定奶乳制品中細菌含量的電化學生物傳感器，并對牛奶中的雜菌進行了測量。研究結果表明，該生物傳感器能有效的測定鮮奶中的微生物含量。它相對于傳統(tǒng)活菌落檢測方法相比，具有快速、簡便、實時檢測等優(yōu)點[8-9]。

2 基于細菌直接計數(shù)法的微生物快速檢測技術

基于細菌直接技術法的微生物快速檢測技術主要包括流式細胞儀（FCM）和固相細胞計數(shù)（SPC）法。FCM通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號基本上反映了細胞體積的大小，熒光信號的強度則代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，由此可通過儀器檢測散射光信號和熒光信號來估計微生物的大小、形狀和數(shù)量。流式細胞計數(shù)具有高度的敏感性，可同時對目的菌進行定性和定量[10]。2000年，澳大利亞麥夸里大學的S.Gunasekera等實現(xiàn)了用流式細胞術快速檢測牛奶中的菌落總數(shù)，解決了牛奶中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)顆粒對流式細胞技術中的影響問題，建立了基于清除牛奶中酶的應用流式細胞術快速檢測（1 h以內(nèi)）牛奶中菌落總數(shù)的方法。當把細菌添加到經(jīng)過超熱處理的牛奶中時，在流式細胞術檢測與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法二者之間具有很好的相關性（r≥0.98）。對于原料奶的檢測呈顯著相關（P＜0.01），并且二者之間具有很好的相關性（r=0.91）。此方法的檢測限為≤104/mL牛奶，滿足許多國家和地區(qū)的安全標準[11]。目前，流式細胞技術已經(jīng)建立了細菌總數(shù)、致病性沙門菌、大腸埃希氏菌等的快速檢驗方法。

固相細胞計數(shù)可以在單個細胞水平對細菌進行快速檢測[12]。濾過樣品后，存留的微生物在濾膜上進行熒光標記，采用激光掃描設備自動計數(shù)。每個熒光點可直觀地由通過計算機驅(qū)動的流動臺連接到ChemScan上的落射熒光顯微鏡來檢測，尤其對于生長緩慢的微生物，檢測用時短使該方法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)平板計數(shù)法[13]。2001年，H.Perry-O'Keefe等應用過濾器肽核酸原位雜交對特殊微生物進行檢測、識別和計數(shù)。基于膜過濾方法，通過原位雜交來分析小菌落，過氧化物酶標記的PNA探針，靶點為特異的rRNA序列，再利用直觀的化學發(fā)光反應，使小菌落能夠在膜上形成發(fā)光的小亮點而被觀測到。此方法與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相比有95%～100%的相似。應用這種方法比常規(guī)的培養(yǎng)法檢測革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及酵母菌時間要縮短3倍以上[14]。

3 基于PCR的微生物快速檢測技術

聚合酶鏈式反應PCR（Polymerase Chain-Reaction）是美國科學家Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。故又稱為基因的體外擴增法。它可以在試管中建立反應，數(shù)小時后能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬乃至千百萬倍。即可將皮克（pg）水平的DNA特異地擴增到能夠檢測的微克（μg）水平。無須通過繁瑣費時的基因克隆程序，便可以獲得足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝。微生物快速檢測中，可以利用PCR技術將特異性DNA片段進行擴增識別目標細菌。由于PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個細菌的拷貝基因，因此在細菌的檢測中只需短時間增菌甚至不增菌，即可通過PCR進行篩選，節(jié)約了大量時間。

2007年，美國疾病與預防控制中心的F.C.Tenover利用PCR技術實現(xiàn)了耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌、耐多藥結核分枝桿菌等常規(guī)難以快速檢測的多種菌的快速檢測。基于分子生物學的檢測技術能夠在約1 h從鼻孔中檢測出耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌，約4 h從直腸樣本中分離出腸球菌的耐萬古霉素A和B基因。新型焦磷酸實驗可以在一天之內(nèi)從分枝桿菌陽性株肉湯培養(yǎng)基上直接得到耐多藥結核分枝桿菌的結果。這些數(shù)據(jù)對醫(yī)生在治療以及感染控制方面都有所幫助[15]。當然，PCR技術也存在一些缺點：食物成分、增菌培養(yǎng)基成分和其他微生物DNA對Taq酶具有抑制作用，可能導致檢驗結果假陰性；操作過程要求嚴格，微量的外源性DNA進入PCR后可以引起無限放大產(chǎn)生假陽性結果，擴增過程中有一定的裝配誤差，會對結果產(chǎn)生影響等等。

4 基于免疫學的微生物快速檢測技術

免疫學技術通過抗原和抗體的特異性結合反應，再輔以免疫放大技術來鑒別細菌。免疫方法的優(yōu)點是樣品在進行選擇性增菌后，不需分離，即可采用免疫技術進行篩選。由于免疫法有較高靈敏度，樣品經(jīng)增菌后可在較短的時間內(nèi)達到檢出度，抗原和抗體的結合反應可在很短時間內(nèi)完成[16]。膠體免疫層析法能快速、靈敏檢測金黃色葡萄球菌，應用膠體金免疫層析法檢測食品中的沙門菌，簡便快速，無需特殊儀器設備，適合現(xiàn)場檢測之用。

2005年，M.N.Widjojoatmodjo等實現(xiàn)了應用磁免疫技術，再結合PCR方法快速檢測沙門氏菌。他們使用涂有沙門氏菌單克隆抗體的磁性粒子從樣品中提取細菌，結果獲得了一些細胞溶解的，包含細菌DNA的浮在表面的，來自鼠傷寒沙門氏菌中的引物，DNA復制起點163 bp的區(qū)域。引物的特異性被設定在PCR中，所有25個沙門氏菌屬的菌株都用來進行試驗，但不包括腸桿菌科的其他19個屬的菌種。100 CF敏感度的鼠傷寒沙門氏菌通過瓊脂糖凝膠電泳染色得到的增強的樣品。放大的產(chǎn)物通過Southern雜交得到了10倍于初始的敏感度。107cfu的大腸桿菌檢測水平?jīng)]有任何干擾。因此磁免疫PCR方法能在5 h之內(nèi)，對于快速檢測醫(yī)學樣品和食品中的沙門氏菌更加有效[17]。

5 集成化商品微生物快速分析系統(tǒng)

微生物快速檢測除了在研究層面上不斷創(chuàng)新與深入，同時商品化實用型儀器也不斷涌現(xiàn)，例如法國梅里埃VITEK系列全自動微生物分析系統(tǒng)、美國的mini-VIDAS熒光酶標分析儀、意大利的ATB微生物分析系統(tǒng)以及美國的Bactometer全自動微生物檢測計數(shù)儀等等。此類實用型微生物分析儀一般都由傳統(tǒng)生化反應及微生物檢測技術與現(xiàn)代計算機技術相結合，運用概率最大近似值模型進行自動微生物檢測，可鑒定由環(huán)境、原料及產(chǎn)品中分離的微生物。一般僅需4 h～18 h即可報告結果，以常規(guī)法鑒定細菌，只能得到是或不是某種菌，要想知到是哪種菌還要做大量、煩瑣的生化試驗，而集成化商品化分析儀一般在短時間內(nèi)即可直接報告是什么菌。法國生物梅里埃集團公司出品的Vitek-AMS自動微生物檢測系統(tǒng)屬當今世界上最為先進、自動化程度最高的細菌鑒定儀器之一。Vitek對細菌的鑒定是以每種細菌的微量生化反應為基礎，不同種類的Vitek試卡（檢測卡）含有多種的生化反應孔，可達30種，可鑒定405種細菌[18]。用AMS明顯縮短腸道菌生化鑒定的時間，如鑒定沙門菌屬只需4 h，鑒定志賀氏菌屬只需6 h，鑒定霍亂弧菌等致病性弧菌亦只需4 h～13 h。總之，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，可以預料在不遠的將來，傳統(tǒng)的微生物檢測技術將逐漸被各種新型簡便的微生物快速診斷技術所取代。近年來興起的基因探針技術及全自動微生物檢測系統(tǒng)，將從根本上改變微生物的檢測方法，具有非常廣闊的應用前景。

6 總結與展望

微生物檢測技術研究與開發(fā)一直是食品質(zhì)量安全研究的重點、熱點方向之一。傳統(tǒng)的微生物檢測方法雖然消耗的時間長，效率低，但是它仍然廣泛的應用于微生物的檢測，并作為官方檢測標準長期應用于企業(yè)以及相關檢測部門。但是，隨著工業(yè)化的快速發(fā)展以及現(xiàn)代物流技術的進步，對微生物快速檢測的需求越來越大，極大的促進了各種微生物快速檢測技術的研究與開發(fā)。以上介紹的幾種快速檢測技術得到了很好的發(fā)展，并且某些已經(jīng)應用于實際工作當中。但是，總體來說，大部分微生物快速檢測技術還只停留在科學研究階段，對微生物識別的分辨率和計數(shù)的靈敏度還遠達不到實際的要求，例如食品衛(wèi)生檢測標準中大多數(shù)食物的菌落總數(shù)指標限量標準都在103個/mL～105個/mL，有的甚至更低。微生物快速檢測技術在識別分辨率及計數(shù)靈敏度方面還需要進一步的改進和完善。總之，隨著微生物快速檢測技術的發(fā)展，將會有更多的快速檢測技術得到實際應用，并替代傳統(tǒng)分析方法，服務于各類檢測部門。

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Rapid Detection Food Microbiology Research Progress

ZOU Xiao-long,JIANG Chuan,HAO Da-wei
(Lishui Testing Institute of Quality Technical Supervision,Lishui 323000,Zhejiang,China)

2011-12-15

浙江省質(zhì)量技術監(jiān)督局一般項目（20070245）

鄒小龍（1965—），男（漢），高級工程師，碩士，研究方向：食品微生物快速檢測。