不同年齡兔前交叉韌帶切斷后關節軟骨變化的研究

儲 淼 孫立勝 蔣 青

(南京醫科大學鼓樓臨床醫學院關節中心，南京 210008)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是膝關節內的強大韌帶，對維持膝關節的穩定至關重要，通過防止脛骨在股骨上向前移動或向后移動，同時防止膝關節過度伸直，限制內、外旋和內、外翻活動，是膝關節內最容易損傷的韌帶［1，2］。ACL 斷裂后，使平衡能力和本體感覺下降，下肢肌肉的力量和功能也受到影響，使受傷下肢生物力學改變［3，4］，關節軟骨壓力傳導紊亂，增加了軟骨磨損，導致關節軟骨退行性改變，最終導致骨性關節炎的發生［5，6］。本研究以3個年齡段(6、12、24個月)新西蘭大白兔為實驗對象，通過檢測切除兔膝關節ACL后不同時間關節軟骨的損傷程度，在病理學和含水率2個方面觀察年齡對ACL斷裂后軟骨損傷的影響，旨在探討處理不同年齡段患者ACL損傷的最佳方法和時機，為臨床防止或延緩膝關節軟骨退變的發生、發展提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

新西蘭大白兔30只(為排除性別差異，統一性別為雄兔)。6、12、24月齡各10只［南京市鼓樓醫院動物中心，SCXK(蘇)2007－0004］，按年齡分為A、B、C 3組。相同年齡的10只兔子，再隨機分為5組，每組2只。設置5個時間點，分別為術后5、10、15、20、25 周。雙側膝關節自身對照，切斷右膝關節ACL，以右側作為陽性對照側，左側膝關節僅行膝關節切開術，作為假手術陰性對照側。實驗過程中對于動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 方法

1.2.1 手術方法 肌肉注射麻醉(30 g/L戊巴比妥，劑量0.03 mg/kg)后，將其固定在動物實驗手術臺上。膝部剃毛，碘酒、酒精消毒皮膚，鋪洞巾，嚴格按無菌操作原則進行手術。右膝關節內側做切口至關節腔，切口長約3 cm，將髕骨、髕韌帶推向外側，屈曲膝關節，暴露ACL，用絲線拉起韌帶完全切斷，逐層縫合切口;同樣方法顯露左膝關節腔，但不切斷ACL，作為假手術陰性對照。沖洗關節腔后，1號絲線逐層縫合切口。術后1周所有實驗動物每天肌注80萬U青霉素預防感染［7］。分籠飼養，每籠1兔，不做固定處理，自由進食、活動，強迫兔子每日活動半小時，分2次驅趕。

1.2.2 標本制作與大體觀察 ①大體觀察:分別于術后5、10、15、20、25周用空氣栓塞法處死各時間點實驗兔，解剖顯微鏡下觀察股骨內髁關節面軟骨改變，按以下原則評分［8］:0分:關節面光整，色澤如常;1分:關節面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗;2分:關節面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表、中層:3分:關節面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層;4分:軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露。②軟骨標本的制作:手術取下膝關節股骨內髁，固定于10%中性福爾馬林液中3 d，15%EDTA脫鈣、依次酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，切片。

1.2.3 Masson染色步驟 常規脫蠟至蒸餾水洗，蘇木素染5～10 min，流水沖洗。1%鹽酸酒精稍分化，流水沖洗數分鐘返藍。麗春紅酸性品紅染液染5～10 min，蒸餾水快速沖洗。磷鉬酸溶液處理約5 min，不用水洗直接用苯胺藍染液復染5 min。1%冰醋酸處理1 min。95%酒精、無水酒精快速脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。在南京大學模式動物研究所觀察Masson染色玻片。

1.2.4 軟骨生化檢查 在各時間點處死動物后立即取下兩側脛骨平臺全層軟骨，用濾紙吸干其表面水分，精確稱取濕重。丙酮脫水后在真空干燥器中室溫下干燥至恒重，精確稱其干重，計算含水率。

2 結果

2.1 大體觀察評分結果

24月齡組的兔子20周和25周組各有1只實驗動物死亡。觀察股骨內髁關節面處，ACL切斷陽性側:術后5周時6、24月齡兔關節面略有粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗，12月齡兔可見關節面磨損較明顯;術后10周3組兔滑膜輕度充血增生，關節液量少許增多，透明，關節軟骨面出現表、中層的軟骨缺損;術后15周3組兔病變有加重趨勢，滑膜增生明顯，滑液量少但稍混濁逐漸，關節面粗糙、軟骨小裂隙增多、色澤灰暗，6、12月齡組有軟骨損傷達深層;術后20周軟骨病變更明顯，滑膜部分呈結節樣增生，滑液量少但混濁，12月齡組兔軟骨損傷較重，部分軟骨下骨暴露，有少量骨贅形成;術后25周關節面基本糜爛，軟骨缺損可深達軟骨中、深層，滑膜增生、破壞明顯，6月齡組和12月齡組可見軟骨剝脫，骨質暴露，還有部分骨贅形成。與右側相比，假手術陰性對照側(左側)的關節軟骨改變不明顯。表1為不同月齡組術后不同時間關節軟骨損傷的評分情況，3組術后不同時間軟骨退變有逐漸加重的趨勢，12月齡兔發展最快，基本每5周就進展1級，術后20周時已經到達最嚴重的4級，軟骨磨損嚴重，已有部分骨贅形成;6月齡兔進展稍慢，術后25周時到達4級;24月齡兔進展較慢，術后25周時仍未到達4級。

表1 關節軟骨損傷評分情況

2.2 軟骨Masson染色結果

圖1 術后5周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(陽性對照側)ACL切斷Masson染色切片 6月齡兔ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原綠染，表層軟骨細胞密集，表層略有不光整，軟骨細胞核深染，退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現紅染。12、24月齡兔ACL切斷陽性對照側表現與6月齡兔大致相同，但是從潮線升起使未鈣化軟骨出現紅染的紅色火焰狀突起沒有6月齡明顯 Masson染色 ×40 圖2 術后10周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(陽性對照側)ACL切斷Masson染色切片 6月齡兔ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原綠染，表層不光整明顯;退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現紅染，較術后5周時明顯且范圍廣布，可見軟骨表層纖維化。12、24月齡兔ACL切斷陽性對照側表現與6月齡兔大致相同，12月齡兔切片中有較多血管翳從潮線通過，侵蝕破壞關節軟骨Masson染色 ×40 圖3 術后15周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(陽性對照側)ACL切斷Masson染色切片 24月齡兔ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原淺綠染，疏松，表層不光整，有裂口，軟骨表層纖維化;6月齡兔軟骨表面出現明顯的缺損;12月齡兔軟骨丟失嚴重 Masson染色 ×40 圖4 術后20周時從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(陽性對照側)ACL切斷Masson染色切片 24月齡ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原淺綠染，血管翳稍有增多，簇集細胞出現頻率增加較之15周時變化略有增加;6月齡與12月齡兔軟骨損傷加重，軟骨纖維化與血管翳增生更為明顯 Masson染色 ×40圖5 術后25周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(陽性對照側)ACL切斷Masson染色切片 24月齡兔ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原淺綠染，疏松且紊亂，潮線模糊不清。6、12月齡兔軟骨損傷更為嚴重，尤其是12月齡兔，損傷最為嚴重，軟骨殘余量少，大部分磨損、纖維化，細胞數少，鈣化層難以分辨 Masson染色 ×40

①術后5周時關節軟骨Masson染色結果見圖1。6月齡兔ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原綠染，表層軟骨細胞密集，表層略有不光整 ，軟骨細胞核深染，退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現紅染。12、24月齡兔ACL切斷陽性對照側表現與6月齡兔大致相同，但是從潮線升起使未鈣化軟骨出現紅染的紅色火焰狀突起沒有6月齡兔明顯。②術后10周時關節軟骨Masson染色結果見圖2。6月齡兔ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原綠染，表層不光整明顯;退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現紅染，較5周時明顯且范圍廣布，可見軟骨表層纖維化。12、24月齡兔ACL切斷陽性對照側表現與6月齡兔大致相同，12月齡兔切片中有較多血管翳從潮線通過，侵蝕破壞關節軟骨。③術后15周時關節軟骨Masson染色結果見圖3。24月齡兔ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原淺綠染，疏松，表層不光整，有裂口，軟骨表層纖維化:6月齡兔軟骨表面出現明顯的缺損;12月齡兔軟骨丟失嚴重。④術后20周時關節軟骨Masson染色結果見圖4。24月齡ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原淺綠染，血管翳稍有增多，簇集細胞出現頻率增加較之15周時變化略有增加;6月齡與12月齡兔軟骨損傷加重，軟骨纖維化與血管翳增生更為明顯。⑤術后25周時關節軟骨Masson染色結果見圖5。24月齡兔ACL切斷陽性對照側:軟骨膠原淺綠染，疏松且紊亂，潮線模糊不清。6、12月齡兔軟骨損傷更為嚴重，尤其是12月齡兔，損傷最為嚴重，軟骨殘余量少，大部分磨損、纖維化，細胞數少，鈣化層難以分辨。

2.3 含水率的測定

3組各時間點軟骨含水率見表2。ACL切斷的右側軟骨含水率基本上比左側高，隨著軟骨損傷從輕到重的發展，右側(ACL切斷，陽性對照側)軟骨含水率呈現出先升高后降低的趨勢。6、12月齡組兔軟骨損傷速度較快，所以在10～15周時出現含水率從高點下降的趨勢，而24月齡兔軟骨損傷慢，在20～25周時才出現。

表2 不同年齡組ACL切斷術后不同時間點左、右兩側軟骨含水率 %

3 討論

ACL損傷多發生在處于非功能位的膝關節，大部分發生在足球、籃球、滑雪等運動中，當人體在進行急停、扭轉、落地或者剪切運動時。當膝關節由屈曲40°主動伸至完全伸直時，脛骨過度內旋時，膝關節過度外翻及內翻時，ACL承受最高的負荷［9］。ACL損傷后，膝關節不穩定而導致的關節軟骨繼發性損傷，尤以關節內側間隙的股骨內髁負重區處極易出現軟骨磨損，主要是因為膝關節不穩定，ACL防止膝關節內旋作用消失，運動時關節的應力中心改變，脛股關節面出現剪力作用［10，11］。膝關節不穩定，嚴重影響關節功能，導致活動能力降低，生活也受到影響［12，13］，而且長期以往增加了患膝關節骨性關節炎的風險［14］。軟骨損傷主要還受到年齡因素的影響，不同年齡段，在發生ACL斷裂后，軟骨損傷的程度會不一樣。

本研究通過對6、12、24個月3個不同年齡組的新西蘭大白兔進行研究，比較不同年齡兔ACL斷裂后的軟骨損傷情況。不論是從大體的觀察、評分，還是從Masson染色病理切片的觀察，隨著時間的推移，3個年齡段的兔軟骨損傷有明顯不同的變化。12月齡兔子軟骨損傷最重，到術后25周時已經有骨關節炎的表現;6月齡兔次之，24月齡兔軟骨損傷進展最慢，磨損最輕。6月齡兔因為年輕，自身軟骨有較強的修復作用，如果時間繼續延長，肯定會到達最嚴重的軟骨破壞，導致嚴重骨性關節炎的發生。ACL是膝關節穩定的重要結構，損傷后導致股骨、脛骨在負重時易半脫位，使膝關節不穩，造成膝關節的關節面間接觸面積及壓力改變，致半月板和軟骨損傷。半月板損傷后，其對關節軟骨的保護作用轉變為剪切和磨損作用，使軟骨發生軟化、龜裂、剝離、脫落，受到破壞的軟骨對半月板也會產生一些損害作用，形成惡性循環，時間越長，軟骨損傷越嚴重［9，15，16］。ACL 損傷致關節不穩定，軟骨受力不均勻，易誘導軟骨細胞生理性的改變，甚至發生凋亡，從組織學上可見膠原纖維、蛋白多糖減少。在關節運動中因磨損會產生一些微小顆粒，引起關節內滑膜反應，使關節液中出現腫瘤壞死因子和白細胞介素，加劇了軟骨的損傷［17～20］。

關節軟骨由軟骨細胞和細胞外基質構成。軟骨基質主要包括膠原纖維、蛋白多糖和水，三者的有機結合使關節軟骨具有承受負荷，抵抗應力、張力及減少摩擦的作用，水在其中所占的比例最大。關節軟骨中的水有利于營養和廢物的彌散、交換。本研究結果顯示在每組每個時間點，ACL切斷陽性對照側軟骨含水率比陰性對照側高，而且在3個年齡組中，隨著軟骨損傷從輕到重的發展，ACL切斷陽性對照側軟骨含水率呈現出先升高后降低的趨勢。軟骨中的水分為游離水和結合水兩部分，游離水主要由關節腔滲透進入，滲透壓的大小與蛋白多糖的數量有關;后者與膠原或蛋白多糖內靠著兩者之間的水合作用結合［21］。在軟骨破壞較輕階段，一方面由于軟骨結構的破壞，導致膠原纖維結構改變，膠原蛋白含量下降，這些結構的改變導致軟骨腫脹，增加了滲透壓，從而導致高滲吸水，引起滲透壓的持續增大，含水率的增加［22］。隨著軟骨磨損的越來越嚴重，由于新合成的蛋白多糖分子量較小，導致蛋白多糖與膠原生物學性能降低，同時炎癥介質釋放減少，組織腫脹減輕，水合作用降低，含水率逐漸減小。含水率這一特點也可以使之成為檢測軟骨損傷程度的指標。陰性對照側的膝關節軟骨也有輕度改變，可能是因為該側進行了關節切開手術，手術造成出血、損傷、積血，各種因素激發的炎癥反應引起了關節軟骨應激反應［23］。

本研究使用新西蘭兔作為實驗動物，兔膝關節的結構組成、負重情況、生物力學和人有較大差別，而且本實驗動物數量有限，無法得出完全肯定的結論，但本實驗顯示的膝關節軟骨損傷和年齡的關系與人可能有一定的共性，可供臨床參考。

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