農桿菌介導Chi－linker－Glu融合基因和bar基因轉化玉米莖尖的研究

方永豐，李永生，彭云玲，王芳，王威，穆延召，王漢寧＊

（1.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州730070）

玉米（Zea mays）在糧食生產、飼料及工業原料等方面發揮著重要作用，目前已成為世界上第一大糧食作物［1］。真菌性病害（如大小斑病、莖腐病、穗粒腐病等）及田間雜草嚴重危害玉米的生長發育，導致玉米產量及品質的下降，常規育種培育抗病玉米自交系周期長、效率低，很難滿足生產需要。20世紀70年代興起的植物基因工程技術打破了物種之間基因交流的界限，可以將有利的外源基因導入受體植物中，為作物遺傳改良帶來了新的途徑。但是，單子葉植物不是農桿菌的天然宿主，玉米遺傳轉化技術一直發展緩慢。1987年Grimsley等［2］首先用農桿菌將玉米條紋病毒（maize streak virus）的cDNA導入玉米幼苗分生組織或靠近生長點的部位，98%的玉米葉片表現出病毒感染性狀，表明T－DNA已經轉化進玉米細胞，這一研究成果極大地推動了農桿菌介導的玉米遺傳轉化研究。1996年Ishida等［3］用超雙元載體轉化A188的幼胚，轉化率高達5%～30%，外源基因能夠穩定表達，并且70%的轉基因植株可育，該實驗有力地證明了農桿菌對單子葉植株與雙子葉植物具有相同的轉化機制，這是玉米遺傳轉化研究中里程碑式的工作。玉米遺傳轉化技術正日趨成熟，世界上有大批玉米轉基因新品系得到推廣種植，取得了顯著的經濟及社會效益［4］。

目前常用的玉米遺傳轉化方法有基因槍法［5］、農桿菌介導法［3］，花粉管通道法［6，7］等，農桿菌介導法由于成本低、操作方便而備受青睞。受體材料通常是幼胚或成熟胚的胚性愈傷組織，由于受基因型限制較大，生產上常用的優良玉米自交系誘導愈傷困難，轉基因技術難以大規模推廣應用，因此選擇取材方便且轉化不受基因型限制的轉化系統成為玉米轉基因研究的新方向。幼嫩莖尖的分生組織具有很強的分生能力，是玉米遺傳轉化的良好受體，Sidorov等［8］用農桿菌侵染由幼苗莖段誘導的愈傷組織，轉化率在2%～10%，這一研究突破了受體取材的季節限制，但莖段愈傷組織誘導明顯受基因型限制；Wang等［9］用農桿菌侵染損傷的玉米莖尖分生組織，雖然最終轉化率為0.6%，卻具有不受季節及基因型限制、操作簡單、轉化周期短等優點，目前該方法已同時在棉花（Gossypiumspp.）［10］、小麥（Triticum aestivum）［11］、玉米［12－14］中得到應用。

幾丁質（聚乙酰胺基葡聚糖，chitin）和β－1，3－葡聚糖（β－1，3－glucan）是絕大多數真菌細胞壁的主要成分，而幾丁質酶（chitinase，Chi，EC3.2.1.14）和β－1，3－葡聚糖酶（β－1，3－glucanase，Glu，EC3.2.1.39）分別催化二者的水解反應。Mauch等［15］研究證實，β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶能夠協同抑制真菌生長，他們分離并純化了豌豆（Pisum sativum）豆莢中的β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶，經過體外抑菌試驗證實用這2種酶共同處理18種真菌之后，其中15種真菌的生長受到抑制，國內學者的研究［16，17］也證實了這一點。Broglie等［18］首次從菜豆（Phaseolus vulgaris）中分離出幾丁質酶基因，并將其置于花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子控制下轉化煙草（Nicotiana tabacum）和油菜（Brassica campestris），轉基因植株對猝倒病產生了一定的抗性；將幾丁質酶基因和葡聚糖酶雙價基因導入水稻（Oryza sativa）、棉花、煙草、小麥等作物，轉基因植株分別對稻瘟病、黃萎病、炭疽病和赤霉病等真菌性病害表現出一定的抗性［19－24］。目前將幾丁質酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因同時轉入玉米尚未見報道，本研究采用pbi121－Chi－linker－Glu－bar植物表達載體［25，26］，通過轉化骨干玉米自交系鄭58，以期獲得具有抗真菌、抗除草劑的玉米種質新材料，同時為多基因共同轉化玉米提供相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米自交系鄭58（由甘肅富農高科技種業有限公司提供），質粒pbi121－chi－linker－glu－bar（圖1）及附有該質粒的農桿菌工程菌LBA4404、EHA105及C58c1由本實驗室保存。預混型DNA聚合酶（Premix Taq）、DL2000TMDNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，PCR檢測引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，Basta除草劑購自西安羅森伯科技有限公司，乙酰丁香酮（AS）購自Sigma－Aldrich公司，其他試劑為國產或進口分析純。

圖1 pbi121－ubi－chi－linker－glu－ubi－bar載體結構圖Fig.1 Diagram of plant expression vector pbi121－ubi－chi－linker－glu－ubi－bar

1.2 轉化用培養基

YEP培養基：牛肉膏10g／L、蛋白胨10g／L、氯化鈉5g／L（固體培養基加瓊脂15g／L），pH 值為7.0，121℃滅菌15min。萌發培養基：MS＋蔗糖20g／L＋瓊脂5.7g／L，pH值為5.8～6.0，121℃滅菌15min。重懸培養基：MS＋蔗糖20g／L＋葡萄糖10g／L＋水解酪蛋白0.2g／L，pH 值為5.1～5.5，121℃滅菌15min。

1.3 農桿菌工程菌的制備

將附有載體的農桿菌在含有利福平（50mg／L）和卡那霉素（50mg／L）的YEP固體培養基上劃線培養1～2 d，從平板上挑取單菌落，接種于含有相應抗生素的YEP液體培養基中28℃振蕩培養，培養至對數期（OD600約為0.5）后在4 000r／min轉速、室溫下離心5min收集菌體，用重懸培養基稀釋至不同濃度，侵染前加入乙酰丁香酮（AS）。

1.4 除草劑篩選濃度的確定

將Basta除草劑配成50，100，200，500，1 000mg／L五種不同質量濃度的水溶液，以蒸餾水作為空白對照，噴灑培養10d后長勢一致的鄭58非轉基因植株，每個處理60株，以葉片掛液珠為準，分別于第3，7，15天觀察葉片變化，統計植株存活率，以確定轉化植株的最佳篩選濃度。

1.5 轉化條件的選擇

農桿菌菌液濃度選擇：用OD600為0.2，0.4，0.6，0.8及1.0的農桿菌重懸液侵染10min，統計轉化率；農桿菌侵染時間的選擇：用OD600為0.6的農桿菌對小苗莖尖分別侵染8～16min，統計轉化率；菌株的選擇：選用3個不同的菌株LBA4404、EHA105及C58c1的農桿菌工程菌，菌液濃度OD600值為0.6，侵染10min，統計轉化率；乙酰丁香酮（AS）濃度的選擇：將重懸菌液中AS濃度分別調整為50，100，150及200μmol／L，菌株選擇LBA4404，用OD600為0.6的農桿菌正常大氣壓下侵染10min，統計轉化率；當農桿菌LAB4404菌液濃度OD600值為0.6，AS濃度為100μmol／L時，分別在正常大氣壓（101kPa）和50kPa負壓下侵染10min，統計轉化率；以上各因素均以除草劑抗性植株百分數作為評定標準，轉化率（%）＝除草劑抗性植株數／移栽后成活植株數×100%，數據統計及多重比較采用Excel 2010及SPSS 13.0完成。

1.6 農桿菌介導的玉米莖尖遺傳轉化

挑選整齊飽滿的自交系種子，在超凈工作臺上進行消毒，依次為70%乙醇8min、升汞6min、無菌水洗滌3次，然后用加1.5倍種子體積無菌水室溫下浸泡4～6h后，再用升汞消毒10min、無菌水洗滌5次，放入底部墊有無菌濾紙并用無菌水浸濕的培養皿中，28℃黑暗條件培養3～4d直到種子出芽。將發芽的種子轉接至萌發培養基上，28℃黑暗條件下繼續培養至芽長為4～6cm時在超凈工作臺上剝離胚芽鞘和幼葉，露出莖尖生長點，用手術刀輕微損傷莖尖用于轉化；將莖尖浸泡在農桿菌重懸液中并置于真空干燥器中在50kPa的負壓下侵染；結束后用濾紙吸干種子上多余的菌液，接種在萌發培養基上23℃黑暗條件下培養3d，直至重新長出新葉。

共培養結束后，將長出新葉的轉化苗用溫水洗掉培養基和菌體，移栽到花盆后放入人工氣候室中，光照強度為500μmol／（m2·s），白晝溫度為27／22℃，光周期為12h／12h，濕度為65%。大約2周后用Basta除草劑噴灑葉片進行篩選，10～15d后將存活的植株移栽至溫室中。

1.7 轉基因玉米植株的分子檢測

用CTAB法［27］小量提取抗性植株葉片DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，紫外分光光度計檢測濃度及純度并稀釋至200ng／μL。以抗性植株葉片DNA為模板，用融合基因特異檢測引物CLG－F：GGGAGGCTTCTGCTGACAAG；CLG－R：TTTCCCAAACCAGCTTCACC（退火溫度55.7℃，產物大小607bp）及bar基因特異性檢測引物bar－F：GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC；bar－R：GCACCATCGTCAACCACTACAT（退火溫度61.3℃，產物大小440bp），載體質粒DNA為陽性對照、非轉化植株基因組DNA為陰性對照進行降落PCR檢測［28］。PCR反應體系：Premix Taq 12.5μL，上游引物（10μmol／L）1.0μL，下游引物（10μmol／L）1.0 μL，模板DNA 1.0μL，ddH2O補足25μL。檢測融合基因Chi－Linker－Glu的PCR反應程序為：95℃預變性5 min；94℃變性35s，55.7℃退火40s，72℃延伸1min，10個循環；94℃變性35s，50.7℃退火40s，72℃延伸1 min，25個循環；最后72℃延伸10min，4℃結束程序并保存。檢測bar基因的PCR反應程序為：95℃預變性5 min；94℃變性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸35s，10個循環；94℃變性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸35s，25個循環；最后72℃延伸10min，4℃結束程序保存。

2 結果與分析

2.1 除草劑最佳篩選濃度的確定

Basta為非選擇性廣譜除草劑，主要成分是草丁膦（phosphinothricin），其中L－草丁膦能夠強烈抑制谷胱甘肽合成酶（glutamine synthetase，GS，EC6.3.1.2）的活性，從而導致植物體內由于氨基酸降解等過程產生的氨的毒性無法解除最終使植株死亡。噴施除草劑3d后，植株停止生長，葉尖開始變黃；7d后，噴施高濃度除草劑的植株有一半死亡，低濃度有部分死亡；15d后，噴施1 000，500及300mg／L Basta的植株全部死亡，噴施200，100及50mg／L Basta的植株存活率分別為4.5%，56.2%及86.8%（表1），而對照植株生長正常，因此選用200mg／L Basta作為鄭58轉基因植株的最佳篩選濃度。

表1 不同濃度Basta對鄭58幼苗存活的影響Table 1 Effects of Basta with different concentration on the survival rate of Zheng58seedlings

2.2 菌液濃度和侵染時間對轉化效率的影響

菌液濃度和侵染時間是影響農桿菌介導下植物遺傳轉化的主要因素，菌液濃度過低或過高，都會使轉化效率下降。采用不同濃度的農桿菌重懸液對莖尖進行侵染后，轉化效率呈先上升后下降的趨勢（圖2），其中以OD600值為0.6時侵染效果最佳，平均轉化效率達到4.5%，與其他濃度相比存在極顯著差異（P＜0.01）。在最佳的菌液濃度下，選擇適當的侵染時間可以有效提高轉化效率，本試驗設置6～14min共5個侵染時間，結果發現侵染6～14min其轉化率的差異達到顯著水平（P＜0.05）（圖3），相比而言，侵染12min后其轉化效果最好。

圖2 菌液濃度對轉化效率的影響Fig.2 Effects of bacterial concentration on transformation efficiency

圖3 侵染時間對轉化效率的影響Fig.3 Effects of infection duration on transformation efficiency

圖4 不同菌株對轉化效率的影響Fig.4 Effects of different strains on transformation efficiency

圖5 AS濃度對轉化效率的影響Fig.5 Effects of AS concentration on transformation efficiency

2.3 不同菌株對轉化效率的影響

根癌農桿菌可分為3大菌系，分別為胭脂堿型、章魚堿型以及琥珀堿型，不同菌系的菌株對植物的侵染能力有所不同。用3個不同菌系的農桿菌侵染玉米莖尖，轉化效率之間的差異達到了極顯著水平（P＜0.01），其侵染能力從大到小依次為LBA4404（章魚堿型）＞EHA105（琥珀堿型）＞C58c1（胭脂堿型），選用LBA4404和EHA105均可達到一定的轉化率，而選用C58c1的轉化效率較低（圖4）。

圖6 滲透壓力對轉化效率的影響Fig.6 Effects of osmotic pressure on transformation efficiency

2.4 乙酰丁香酮濃度及真空滲透對轉化效率的影響

農桿菌Vir區基因的活化及表達受到酚類物質的誘導，而乙酰丁香酮是主要的創傷信號或創傷誘導因子，單子葉植物遺傳轉化困難的主要原因之一是由于細胞中不能積累足夠的酚類物質造成的［29］。將侵染液中乙酰丁香酮的濃度調整為150μmol／L時轉化效率較高（圖5），與其他濃度相比差異極顯著（P＜0.01）。在侵染的同時施以50kPa的負壓進行真空滲透能顯著提高轉化效率（P＜0.01）（圖6）。

結果顯示，本試驗中農桿菌介導玉米莖尖遺傳轉化的最佳體系為LBA4404菌液濃度OD600值為0.6、乙酰丁香酮濃度為150μmol／L、50kPa負壓下侵染12min。

圖7 農桿菌介導玉米莖尖遺傳轉化Fig.7 Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of maize shoot apical meristem.

圖8 抗性植株中融合基因Chi－Linker－Glu的PCR檢測Fig.8 PCR detection of fused gene Chi－Linker－Glu in resistant plants

圖9 抗性植株中bar基因的PCR檢測Fig.9 PCR detection of bar in resistant plants

2.5 遺傳轉化及T0代轉基因植株的分子檢測

玉米莖尖遺傳轉化各階段如圖7所示。CTAB法提取32株抗性植株葉片基因組DNA，以質粒DNA擴增產物為陽性對照，以未轉植株DNA擴增產物為陰性對照，進行降落PCR檢測（圖8，9）。結果顯示，有13株抗性植株分別在607和440bp附近擴增出特異條帶，而未轉化植株沒有相應條帶出現，抗性植株的PCR陽性率為40%，采用莖尖遺傳轉化法轉化率為2.6%，初步證明外源目的基因已整合進玉米基因組中。

3 討論

除草劑臨界濃度的確定對于轉化體篩選至關重要。蔣曉芳［30］、王琨等［31］用昌7－2和鄭58進行除草劑臨界濃度篩選，確定的最佳濃度為200mg／L，本試驗中確定的最佳篩選濃度也為200mg／L，其致死率為95.5%。對轉化植物的PCR檢測結果表明，使用該濃度進行篩選后抗性植株陽性率為40%，表明該臨界濃度會產生較多的假陽性植株，但可以避免由于除草劑濃度過高而殺死部分陽性植株造成轉化率降低。在遺傳轉化試驗中，應根據具體的受體材料基因型確定最適篩選濃度。

農桿菌菌液濃度是影響轉化效率的主要因素，菌液濃度過高，外植體上附著過多的農桿菌，會嚴重影響轉化植株的后期生長；菌液濃度過低，外植體上農桿菌附著不足，轉化效率低下［32，33］。本研究中菌液濃度以OD600值為0.6時轉化效率最高，這與孫傳波等［13］的研究結果一致。因為此時的農桿菌接近對數生長期，侵染活力較強，同時在該濃度下進行侵染對莖尖的傷害也較小，隨著菌液濃度增大，轉化植株在后期會出現心葉枯死，造成轉化效率下降，這可能是由于農桿菌菌體密度較大，部分植株由于菌體附著過多導致過早死亡。鞏健和楊芳［12］的研究結果表明玉米莖尖遺傳轉化侵染時間為5～10min均可，本研究選用6～14min共5個侵染時間進行侵染后發現，適當延長侵染時間可以有效提高轉化效率，隨著侵染時間的增長，轉化效率有所提高，但以侵染12min后最佳。有研究表明［34］，單子葉植物遺傳轉化以附有超雙元載體的農桿菌菌株LBA4404進行侵染效果最好，本試驗中采用不同農桿菌菌株進行侵染，經過除草劑篩選后也發現LBA4404轉化效率最高，C58c1最低。

目前報道的玉米遺傳轉化所用的外植體材料主要是幼胚和成熟胚及其愈傷組織，用于愈傷組織誘導的玉米材料僅限于A188、HⅡ及其衍生品種，其中以HⅡ的幼胚愈傷組織的轉化效率最高［35］。盡管如此，由于幼胚的取材受到季節限制而且玉米幼胚的離體培養基因型依賴性強，使得玉米遺傳轉化技術的應用受到了限制。

以莖尖分生組織作為受體材料，由于莖尖分生組織在經過農桿菌侵染后很容易再生出植株，避免了組織培養過程，同時克服了由于基因型障礙造成轉化植株再生困難的缺點，該方法可以作為改良國內骨干玉米自交系中個別不良性狀的首選方法。采用莖尖遺傳轉化系統得到的T0代植株往往為嵌合體，因而不能在T0代進行過多鑒定，PCR檢測只能初步證明外源基因是否整合進植物基因組中，其整合特性還需采用分子雜交等方法對后代植株進行進一步鑒定分析。

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