基于葉綠體atpB－rbcL序列探討猬草屬和賴草屬植物的系統發育和母系起源

劉靜，張海琴，凡星，沙莉娜，曾建，周永紅，4＊

（1.四川農業大學成都校區小麥研究所，四川 成都611130；2.四川農業大學生命科學與理學院，四川 雅安625014；3.四川農業大學成都校區資源與環境學院，四川 成都611130；4.四川農業大學作物基因資源與遺傳改良教育部重點實驗室，四川 成都611130）

小麥族（Triticeae）是禾本科（Poaceae）植物中十分重要的類群，既包含有重要的糧食作物如小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare），也有許多優良的牧草資源如羊草（Leymus chinensis）和老芒麥（Elymus sibiricus）等［1］?；邴滎愖魑锖湍敛葙Y源的開發、生態保護與重建的需要，理清小麥族內物種分類問題及系統發育關系尤為重要。

猬草屬（Hystrix）是小麥族的一個多年生小屬，Moench［2］根據穎強烈退化或缺失的特征以Hystrix patula為模式種建立。根據Baden等［3］的分類系統，猬草屬有6種3變種：Hystrix patula、猬草（H.duthiei）、長芒猬草（H.duthiei ssp.longearistata）、H.duthiei ssp.japonica、東北猬草（H.komarovii）、高麗猬草（H.coreana）、H.sibirica和H.californica。L9ve［4］認為猬草屬模式種 H.patula具有與披堿草屬（Elymus）相同的StH染色體組組成，將猬草屬作為披堿草屬的一個組處理。然而，Jensen和 Wang［5］根據染色體組分析結果認為，高麗猬草和H.californica含有與賴草屬（Leymus）植物相同的NsXm染色體組組成，并將它們組合到賴草屬中。Zhang等［6］根據細胞遺傳學和染色體組原位雜交資料，報道H.patula含有StH染色體組，而猬草和長芒猬草含有NsXm染色體組。Ellneskog－Staam等［7］通過基因組原位雜交（GISH）和Southern雜交分析認為，猬草、長芒猬草和高麗猬草含有Ns1Ns2染色體組，而東北猬草具有與猬草屬模式種H.patula相似的StH染色體組。因此，猬草屬不是一個單系類群，自建屬以來，屬的界限和分類地位以及物種的染色體組組成，一直處于爭論之中。

賴草屬是小麥族中重要的多年生異源多倍體屬，該屬植物約有30個種，從北海的沿岸地區，越過中亞到東亞直至阿拉斯加和北美西部的廣闊地域均有分布。賴草屬物種倍性變化從四倍體（2n＝4x＝28）到十二倍體（2n＝12x＝84），由2個基本的染色體組Ns和Xm組成［1，8］。通過形態學觀察、染色體組分析及分子資料分析，認為Ns染色體組來源于新麥草屬（Psathyrostachys）［1，4，8－12］，而 Xm 染色體組的來源尚不確定［8］。迄今為止，來源于擬鵝觀草屬（Pseudoroegneria）的St染色體組［13］、冠麥草屬（Lophopyrum）的Ee染色體組［14］、Eb染色體組［4］、新麥草屬的Ns染色體組［15］、冰草屬（Agropyron）的P染色體組和旱麥草屬（Eremopyrum）的F染色體組［11－19］被推測是Xm染色體組的供體來源。

細胞核基因資料已廣泛應用于小麥族植物的遺傳多樣性和系統進化研究［11，16－18］，而細胞質基因組具有單拷貝及母系遺傳的特征，在植物系統與進化研究中具有更好的利用價值。rbcL、ndhF、trnL－F等葉綠體基因或基因間隔區序列已成功應用于研究小麥族賴草屬、披堿草屬等類群的系統關系、網狀進化及母系起源問題［19－23］。Sha等［19］利用單拷貝核基因DMC和葉綠體trnL－F分子序列對猬草屬和賴草屬系統分析時發現，猬草屬物種具有不同的母本起源，猬草、長芒猬草及歐亞分布的賴草屬植物的母本來源為新麥草屬植物，高麗猬草和東北猬草與北美分布的賴草的母本來源可能是冰草屬的P染色體組。Liu等［20］根據ITS及葉綠體trnL－F序列分析發現：歐亞分布的賴草屬植物母本起源為新麥草屬，而北美分布的賴草屬植物母本來源仍然未知，但推測不為新麥草屬。

葉綠體atpB－rbcL序列是位于編碼ATP合成酶β亞基和核酮糖1，5二磷酸羧化酶大亞基基因之間的非編碼區域，Nishikawa等［24］利用該序列探討了大麥屬的系統與進化。本研究利用葉綠體atpB－rbcL序列對猬草屬及其近緣屬植物進行系統發育分析，主要目的在于：1）分析猬草屬和賴草屬植物的系統關系；2）探討猬草屬與賴草屬植物可能的母本起源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共46份，包括5個猬草屬物種、來自北美、中亞及青藏高原的22個賴草屬物種、2個披堿草屬物種，以及來自小麥族8個不同基本染色體組的17個二倍體材料，包括4個新麥草屬（Ns染色體組）、2個擬鵝觀草屬（St染色體組）、2個大麥屬（Hordeum，H染色體組）、3個冰草屬（P染色體組）、2個旱麥草屬（F染色體組）、反穎南麥（Australopyrumretrofractum，W 染色體組）、簇毛麥（Dasypyrumvillosum，V 染色體組）、長穗冠麥草（Lophopyrumelongatum，Ee染色體組）、百薩冠麥草（L.bessarabicum，Eb染色體組）等物種。旱雀麥（Bromus tectorum）作為外類群。所有材料的物種名稱、采集編號、來源及GenBank號列于表1。染色體組符號依照Wang等［8］的命名標準。所有材料均種植于四川農業大學小麥研究所多年生種質圃，憑證標本藏于四川農業大學小麥研究所標本室（SAUTI）。

表1 供試材料Table 1 The materials used in this study

續表1 Continued

1.2 DNA提取、擴增和測序

DNA提 取 采 用 改 良 的 CTAB 法［25］。PCR 擴 增 引 物 序 列 為 P1：5′－ACATCGTAAGTACGTGGACCAATAA－3′和P2：5′－TTGGATTCTAAAGCTGGTGTT－3′［24］。PCR擴增反應在 ABI 9700型PCR儀上進行。反應體積為50μL，包括3μL DNA模板（約0.5μg，由Gel Doc圖像分析儀測得），10×ExTaq緩沖液（5μL），2.5mmol／L MgCl2（4.0μL）、2.5mmol／L 4種dNTP混合液（pH 8.0）（4.0μL）、15μmol／L正、反向引物（各1.5μL），5U／μL ExTaq酶（0.6μL）和ddH2O（30.4μL）。PCR反應條件為：94℃預變性4min；94℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸2min，35個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物用1.2%的瓊脂糖進行電泳，用OMEGA試劑盒（OMEGA Bio－Tek）進行割膠回收。然后，以pMD18－T載體（Takara）為連接載體，DH10B作為宿主菌，對目的片段進行克隆。每份材料選取3～5個陽性克隆用于DNA序列測序。序列測定由上海華大生物技術有限公司完成。所有序列均進行雙向測序。DNA提取到測序完成于2009年3－11月。

1.3 基因序列分析

根據新麥草（Psathyrostachys juncea）的atpB－rbcL序列（GenBank序列號 AB078409）［24］對本研究獲得的序列進行確認。采用DNAMAN軟件包（version 5.2.10；Lynnon Biosoft，http：／／www.lynnon.com）對序列進行多重排定后再輔以手工校正，并進行序列長度變異、插入／缺失（Indel）分析。序列的堿基組成及替代用MEGA 4.0（Kumar S，Tamura K，Jakobsen I，Nei M，http：／／www.megasoftware.net）進行統計。序列變異位點采用PAUP4.0b10（Swofford D L，Sinauer Associates，http：／／www.sinauer.com）進行統計?；谵D換和顛換與遺傳距離的線性關系，采用DAMBE（V4.1.33）［26］替代飽和性分析，選用的進化模型是F84。

1.4 系統發育分析

系統發育分析采用最大簡約法（maximum parsimony，MP）和貝葉斯推斷（bayesian inference，BI）。MP分析由PAUP4.0b10Win（Swofford，2003）軟件進行，采用啟發式（Heuristic）搜索，gap作為缺失（missing）處理，數據隨機添加（addseq＝random），重復次數（nreps）為100，樹等分與重連分之交換法（TBR）構建系統樹，計算50%多數一致樹和嚴格一致樹，并采用1 000次重復抽樣（replicates）的自展分析（bootstrap，BS）來檢驗。貝葉斯推斷采用 MrBayes 3.1.2［27］軟件分析。利用 Modeltest 3.7［28］進行模型和參數估計，基于hLRT 標準選擇的最適堿基替代模型是 K81UF。BI分析中，4條馬爾可夫鏈式反應（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）運行1 500 000代，以隨機樹為起始樹，每100代取樣1次，開始的250個樣本作為老化樣本（burn－in samples）舍棄，剩下的樹用于構建50%多數一致性樹（BI樹），并以后驗概率（posterior probability，PP）來評估其拓撲結構的有效性。

2 結果與分析

2.1 序列分析

葉綠體atpB－rbcL基因間隔區序列長度變異為773～813bp，平均GC含量30.5%。所有序列排序后共得到831個排列位點，其中保守位點764個，可變位點46個，簡約信息位點21個。序列飽和性分析顯示轉換和顛換與遺傳距離F84呈線性關系（圖1），表明不同序列和不同位點間突變沒有達到飽和，可用于系統發育分析。

圖1 atpB－rbcL序列的飽和性檢測結果Fig.1 Substitution saturation analysis of atpB－rbcL

2.2 系統發育關系

采用MP和BI兩種方法構建atpB－rbcL系統發育樹。MP分析獲得1 632棵最大簡約樹，樹長（tree length）為72，一致性指數 CI（consistency index）為0.944 4，保持性指數 RI（retention index）為0.966 7，50%多數一致性樹與通過BI分析得到的系統發育樹的拓撲結構基本一致。圖2顯示的是BI系統發育樹。

在構建的BI樹中，所有供試物種分別聚為A、B兩個分支。分支A包括：2個猬草屬物種（猬草、長芒猬草）、4個新麥草屬物種、所有歐亞分布的賴草屬物種以及來自北美的濱麥（L.mollis），統計支持率（97%PP，65%BS），羊草位于該分支底部。分支A中的物種其atpB－rbcL序列上均含有1個5bp的ATATA插入。分支B中，猬草屬模式種H.patula與含StH染色體組的加拿大披堿草（E.canadensis）聚為姊妹支（支持率為100%PP，85%BS），再與含St染色體組的穗狀擬鵝觀草（P.spicata）、擬鵝觀草（P.strigosa），以及簇毛麥（V）、長穗冠麥草（Ee）和百薩冠麥草（Eb）聚為亞支Ⅰ；冰草屬（P染色體組）、旱麥草屬（F染色體組）物種和反穎南麥（W染色體組）聚為亞支Ⅱ；3個北美賴草無芒賴草（L.triticoides）、灰賴草（L.cinereus）、鹽生賴草（L.salinus）聚為亞支Ⅲ；剩下的2個猬草屬物種（高麗猬草、東北猬草）、2個北美分布的賴草屬物種新枝賴草（L.innovatus）、科羅拉多賴草（L.ambiguus）以及2個大麥屬物種布頓大麥（H.bogdanii）、智利大麥（H.chilense）與3個亞支形成平行分支（圖2）。

3 討論

3.1 猬草屬和賴草屬植物的系統關系

猬草屬因以其穎退化乃至缺失的形態特征區別于小麥族其他屬，Baden等［3］認為猬草屬是一獨立有效的屬。然而，染色體組分析和分子系統學研究表明：模式種H.patula含StH染色體組，東北猬草具變異的StH染色體組，而猬草屬的猬草、長芒猬草和高麗猬草含有與賴草屬一致的NsXm染色體組［5－7，29，30］。

本研究中，猬草屬物種聚成不同的分支。猬草屬模式種H.patula與披堿草屬（StH染色體組）及擬鵝觀草屬（St染色體組）物種聚為一支，表明H.patula與披堿草屬植物有較近的親緣關系，支持細胞學及分子系統學研究結果［18，23，29，30］，將H.patula組合到披堿草屬中。猬草、長芒猬草、高麗猬草和東北猬草則與新麥草屬（Ns染色體組）和賴草屬（NsXm染色體組）聚在一起，表明該4種猬草屬物種與新麥草屬和賴草屬植物的系統關系較近，支持猬草、長芒猬草、高麗猬草含NsXm染色體組，并將它們組合到賴草屬中的分類處理［5，6］。

關于東北猬草的染色體組組成，有不同的報道。Ellneskog－Staam等［7］認為東北猬草的染色體組組成為StH；而分子系統學研究及染色體組特異RAPD分析表明，東北猬草與含Ns染色體組的新麥草屬和賴草屬親緣關系較近［30－32］。本研究中，東北猬草與高麗猬草及北美分布的賴草屬物種聚在一支，而沒有與含StH染色體組的披堿草屬及H.patula聚類，表明東北猬草與賴草屬物種關系較近，而與含StH染色體組的披堿草屬物種親緣關系較遠。

猬草和長芒猬草與柴達木賴草（L.pseudoracemosus）等中亞分布的賴草屬物種及含Ns染色體組的新麥草屬物種聚為一支，高麗猬草、東北猬草則與北美分布的賴草屬物種處于另一分支，表明猬草、長芒猬草與中亞分布的賴草屬物種關系更為緊密，而高麗猬草和東北猬草與北美分布的賴草屬物種關系密切。單拷貝核基因DMC1和Acc1的分子數據也顯示賴草屬物種存在歐亞和北美類群的差異［11，19］。Fan等［11］對世界范圍內的賴草屬植物分子系統與進化研究推測：北美賴草屬植物很可能是從東亞經由白令陸橋向北美擴散的。從地理分布上看，高麗猬草、東北猬草處于歐亞大陸東端，與白令海峽接近。本研究結果也表明高麗猬草、東北猬草與北美賴草具有較近的親緣關系。

Wen［33］指出相似的生境可能產生相似的選擇壓，從而導致物種形成相近的形態變異。猬草屬植物常生長于溫暖、潮濕的自然環境中，含不同染色體組組成的物種其形態上的相似可能是自然選擇中趨同進化的結果。

3.2 猬草屬和賴草屬植物可能的母本起源

細胞遺傳學資料表明：H.patula含有與披堿草屬植物相同的StH染色體組，其中St染色體組起源于擬鵝觀草屬，H染色體組來源于大麥屬［1，4，29］。在本研究中，H.patula與含StH染色體組的披堿草屬及擬鵝觀草屬（St）物種聚為一支，表明H.patula及披堿草屬的母本供體為擬鵝觀草屬植物。本研究結果與前人對披堿草屬母本來源的研究結果一致［21，34，35］。同時，擬鵝觀草屬物種與含Ee、Eb及V染色體組的物種聚為一支，表明擬鵝觀草屬的St染色體組和長穗冠麥草的Ee染色體組、百薩冠麥草的Eb染色體組及簇毛麥的V染色體組關系密切，這一結果與基于葉綠體trnL－F序列對相關類群進行的聚類結果一致［20，36］。

圖2 atpB－rbcL序列的BI系統發育樹Fig.2 BI tree inferred fromatpB－rbcL sequences

Sha等［19］和Liu等［20］基于葉綠體trnL－F序列的分析，認為猬草屬及賴草屬物種的母本起源存在多元性。Sha等［19］認為猬草、長芒猬草及歐亞分布的賴草屬植物的母本來源為新麥草屬植物，高麗猬草和東北猬草與北美分布的賴草的母本來源可能是冰草屬的P染色體組。Liu等［20］研究認為歐亞分布的賴草屬植物母本起源為新麥草屬，而北美分布的賴草屬植物母本來源仍然未知，但推測不為新麥草屬。本研究中，具NsXm染色體組的物種其葉綠體atpB－rbcL序列明顯聚為2個分支，其中：猬草、長芒猬草及所有歐亞分布的賴草屬物種與4個新麥草屬植物聚為一個分支（Ns支），而高麗猬草、東北猬草和5個來自美洲的賴草屬物種處于另一分支。結果表明猬草、長芒猬草及歐亞分布的賴草屬物種以新麥草屬（Ns）作為母本供體，而高麗猬草、東北猬草及北美分布的賴草屬植物的母本來源可能為Xm染色體組。由于Xm染色體組確切的二倍體供體物種未知，所以高麗猬草、東北猬草及北美分布的賴草屬植物的母本來源還有待進一步研究。

本研究中，來自北美的濱麥在atpB－rbcL序列上缺少其他北美賴草所共有的7bp（TGAAAAA）的插入片段，而和歐亞賴草聚在一起。從地理分布看，濱麥不僅分布于北美，也廣泛分布于中國北方沿海地區、俄羅斯遠東地區、朝鮮和日本［37］；從形態上看，濱麥與歐亞的沙生賴草（L.arenarius）、大賴草（L.racemosus）形態相似，甚至曾作為沙生賴草的亞種ssp.mollis處理［38］。因此，盡管濱麥來自北美，但與歐亞賴草有更近的親緣關系，其母本供體仍為Ns染色體組。

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