五節芒表型性狀和SSR標記遺傳多樣性分析

薛德，肖亮，艾辛，鄧念丹，蔣建雄，覃靜萍，陳智勇，劉樹玲，易自力

（湖南農業大學生物科學與技術學院，湖南 長沙410128）

五節芒（Miscanthus floridulus）系禾本科（Poaceae）芒屬（Miscanthus）的一個主要種，主要分布于亞洲東南部太平洋諸島至波利尼西亞等地區，在中國大陸主要分布于安徽、湖北、貴州、福建、江蘇、廣東、廣西、江西、湖南、海南等?。?］。早期關于五節芒的研究，主要集中在形態學分類、生物學和生態學特性、細胞學特征及生產應用［1－12］等方面，近年來，由于五節芒具有生物質產量高、燃燒充分、灰分低等特性被認為極具開發潛力的能源植物而引起全世界廣泛的關注［2］。作為能源植物資源，五節芒遺傳多樣性研究是其開發和利用的基礎。近期已有一些關于五節芒遺傳多樣性方面的研究結果發表，但僅限于利用分子標記對局部地區五節芒進行遺傳多樣性分析［13，14］。五節芒在自然界分布廣、易雜交，造成其遺傳背景復雜，利用不同標記對全國范圍內的五節芒進行遺傳多樣性評價，有利于更準確地揭示其遺傳變異情況。因此，本研究利用表型性狀結合SSR分子標記對采自中國各地的53份五節芒種質資源的遺傳多樣性進行評價，以揭示五節芒種群中的遺傳變異度，為五節芒種質資源的合理保護和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本項目組曾對中國的五節芒野生種質資源的分布狀況進行了系統的調查，并從不同地區收集了202份五節芒種質資源，保存在湖南農業大學芒屬植物種質資源圃內，并于2008年至2010年進行了3個年份的表型性狀測量。本研究從中選取53份材料進行表型性狀和SSR標記遺傳多樣性研究。在SSR標記分析中加入2份南荻（M.lutarioriparius）和2份芒（M.sinensis）等近緣種作為外類群，供試材料見表1。

1.2 表型性狀調查與分析

表型性狀調查和數據采集方法參考《牧草種質資源描述規范和數據標準》［15］進行，每份材料隨機取5個單株進行測量，共測量25個表型性狀。包括株高（plant height）、旗葉長（flag leaf length）、旗葉寬（flag leaf width）、最大葉長（largest leaf length）、最大葉寬（largest leaf width）、葉片數（leaf number per tiller）、節數（node number per tiller）、第1節寬邊直徑（first node long axis）、第1節窄邊直徑（first node short axis）、單莖干重（dry weight per tiller）、含水量（moisture content）、花序長（panicle length）、主軸長（panicle main axis length）、一級花序數（first－class branch number of panicle）、二級花序數（second－class branch number of panicle）、三級花序數（thirdclass branch number of panicle）、芒長（awn length）、基盤毛長（callus hair length）、穎長（grain length）、穎寬（grain width）、分蘗數（stem number per plant）、整株干重（dry weight per plant）、基部周長（basal circumference）、出苗－始花天數（days to 10%flowering）、出苗－種子成熟天數（days to seed maturity）。

表1 供試材料Table 1 Plant materials for this study

續表1 Continued

1.3 SSR分子標記分析

1.3.1 總DNA提取 提取基因組總DNA所取材料均為剛長出的幼葉，采用改良CTAB法制備模板DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量和濃度，并稀釋到20ng／μL，冷藏備用。

1.3.2 PCR擴增 本研究中選用了33對玉米（Zeamays）SSR引物和甘蔗（Saccharumofficinarum）ESTSSR引物，其中玉米SSR引物為Sigma－Aldrich產品（St.Louis，MO USA），而甘蔗EST－SSR引物序列由美國Illinois大學Erik Sacks博士提供，由北京奧科生物技術有限公司合成（表2）。PCR擴增在Biometra Tgradient PCR儀上進行。SSR－PCR反應體系為15μL，含有10×PCR buffer 1.5μL、25mmol／L MgCl21.5μL、Primer 1.2μL、10mmol／L dNTPs 0.3μL、20ng／μL模板 DNA 2μL、5U／μL Taq酶0.1μL。以上試劑均購自廣州東盛生物技術有限公司。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性1min，52～62℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸7min。PCR產物經12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后拍照。

1.4 數據處理

采用SPSS 18.0軟件進行表型性狀數據的方差分析、主成分分析（PCA）和聚類分析（UPGMA）。將SSR標記清晰可辨的電泳條帶用于統計分析，在相同遷移率上，有擴增帶的賦值為1，無擴增帶的賦值為0。統計SSR擴增的條帶總數和多態性條帶數，計算多態性位點百分率（PPB，percentage of polymorphic bands），其中，PPB＝NPB／TNB，式中，NPB指多態性條帶數（NPB，number of polymorphic bands），TNB指擴增總條帶數 （TNB，total number of bands）。采用 POPGENE version 1.31軟件計算 Shannon指數（I，Shannon’s information index，Lewontin［1972］）、基因多樣性指數（H，Nei’s［1973］gene diversity）、有效等位基因數（Ne，effective number of alleles），并計算引物多態性信息含量（PIC，polymorphism information content）。利用 NTSYS pc 2.1軟件計算SSR的遺傳相似系數，并利用UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 表型性狀分析

2.1.1 表型性狀變異分析 對五節芒種質資源的25個表型性狀進行統計分析結果表明（表3），性狀間變異系數的平均值為32.61±18.11，變化范圍為6.53（苗－種子成熟）～69.82（整株干重）。其中，變異幅度較大且變異系數在60%以上的性狀有3個：整株干重（69.82%）、三級花序數（65.78%）、二級花序數（64.76%）。25個表型性狀中整株干重變異最大，說明五節芒在生物質產量上存在較大變異。三級花序數和二級花序數變化次之，說明五節芒花序分枝數適合作為一項分類依據來區分種內不同種質。25個表型性狀中變異系數最小的3個為：含水量（10.46%）、出苗至開花天數（6.98%）和出苗至種子成熟天數（6.53%）。五節芒含水量平均值達到54.59%，且種群內變化幅度較小，印證了五節芒是宿根型常綠草本的生物特性。不同采集地緯度差別較大的五節芒野生種質被移栽到同一地點后，通過觀察發現它們的生育期基本保持一致，集中在每年6、7月份開花。這一現象說明五節芒不易受光溫等環境因素的影響，為人工雜交育種提供了便利。除此之外，與產量密切相關的性狀如分蘗數（55.01%）、單莖干重（46.67%）和基盤周長（46.61%）也是變化較大的性狀，這些性狀的變化幅度大說明五節芒的產量及其產量構成因子的可塑性強，通過雜交育種和合理的栽培管理措施能達到理想的選擇效果。

表3 五節芒種質資源表型特征及變異Table 3 Morphological characteristics and variations in accession of M.floridulus

2.1.2 基于表型性狀的主成分分析與聚類分析 主成分分析表明（表4）特征值大于1的前7個主成分的累計貢獻率為74.908%。其中，第1主成分獨立貢獻率為13.909%，因子載荷最大的性狀是第1節寬邊直徑（0.890）和第1節窄邊直徑（0.885）；第2主成分獨立貢獻為12.710%，因子載荷最大的性狀是單株干重（0.872）、分蘗數（0.845）和基部周長（0.775）。第3主成分獨立貢獻率12.538%，因子載荷最大的性狀為三級花序數（0.829）、二級花序數（0.816）和一級花序數（0.759）；第4主成分獨立貢獻率10.881%，因子載荷最大的性狀為花序長（0.846）和主軸長（0.788）；第5主成分獨立貢獻率為9.244%，因子載荷最大的性狀是旗葉長（0.864）和旗葉寬（0.717）；第6主成分獨立貢獻率為9.083%，因子載荷最大的性狀是基盤毛長（0.792）、芒長（0.761）、穎長（0.609）和穎寬（0.555）；第7主成分獨立貢獻率為6.544%，因子載荷最大性狀僅含水量（－0.825）。這7個主成分中，第1主成分由莖粗性狀解釋，第2主成分由產量及其構成因子解釋，第3主成分由花序性狀解釋，第4主成分由生育期性狀解釋，第5主成分由旗葉性狀解釋，第6主成分由小穗性狀解釋，第7主成分由含水量解釋。前3主成分解釋力最高，包括產量構成因素及花序形態兩類性狀，與性狀變異系數所反映的情況基本吻合。

表4 五節芒表型性狀前7個主成分的特征量和貢獻率Table 4 The component scores coefficient matrix，eigenvalue and contributive percentage of principal of M.floridulus

圖1 53份五節芒表型性狀的聚類分析Fig.1 Dendrogram of 53 M.floridulus derived by UPGMA from the phenotype data

基于表型性狀的聚類結果（圖1）表明，53份五節芒可劃分為3大類群：第Ⅰ聚類組只有1份材料，出苗－開花天數為117d，屬于遲花類型，無2級以上花序，花序持久小穗部分易脫落；第Ⅱ聚類組包括6份材料，出苗－開花天數在91～100d，屬于中花類型，2級以上花序數少，花序能持久但小穗易脫落；第Ⅲ聚類組包括46份材料，其出苗－開花的天數為85～90d，屬于早花類型，花序形態為2級以上花序數多，花序易斷小穗易脫落。

2.2 SSR標記分析

2.2.1 SSR標記的多態性分析 33對SSR引物對53份五節芒進行PCR擴增，部分材料的擴增圖譜如圖2所示，其中26對引物具有多態性。26對SSR引物擴增結果見表5。26對SSR引物共擴增出81條DNA帶，平均每對引物擴增3.12條DNA帶，各引物擴增出的條帶數在1～8。多態性條帶74條，平均每對引物2.85條，引物的平均多態性比率（PPB）為91.36%。不同的引物所揭示的供試材料的多態性信息含量（PIC）范圍為0.086～0.374，平均為0.245。結果表明SSR分子標記在五節芒中具有良好的多態性，可以用于五節芒種質間遺傳多樣性分析。各引物所解釋的遺傳多樣性存在一定的差異，53份五節芒遺傳多樣性指數在0.061 1～0.491 2，平均為0.258 7，有效等位基因數在1.064 8～1.965 4，平均為1.417 2，Shannon信息指數為0.126 6～0.684 3，平均為0.400 4，表明53份五節芒間遺傳分化豐富（表5）。

表5 SSR引物的多態性Table 5 The polymorphism of SSR primers

2.2.2 基于SSR標記的遺傳相似性和聚類分析 對擴增結果，計算其相似性系數和遺傳距離。結果表明，53份五節芒遺傳相似性系數為0.693 2～0.965 9，變幅為0.272 7，其遺傳距離為0.030 1～0.303 9，變幅為0.273 8。其中，采自貴州雷山（7、8）2份材料之間的遺傳相似性系數最大（0.965 9），其遺傳距離最近（0.030 1），表明這2份材料親緣關系很近；采自江西南昌（33）與采自安徽金寨（43），相似性系數最?。?.693 2），其遺傳距離最遠（0.303 9），表明這2份材料之間親緣關系較遠。分析結果表明，供試53份五節芒之間差異明顯，具有相對較遠的親緣關系。

圖2 HAU－12擴增產物部分電泳圖Fig.2 An amplification profile using SSR primer pair HAU－12

圖3 53份五節芒SSR標記的UPGMA聚類分析Fig.3 Dendrogram of 53 M.floridulus derived by UPGMA from SSR marker

2.2.3 基于SSR標記的聚類分析 基于遺傳相似性系數，利用UPGMA法（非加權類平均法）構建了53份五節芒材料間的聚類圖（圖3）。在相似性系數為0.79的水平上，可將供試材料分為8個聚類組。其中，第Ⅰ、Ⅱ聚類組分別為2份南荻和2份芒，為外類群。第Ⅲ聚類組有2份材料，分別采自江西修水（9）和安徽金寨（43）。第Ⅳ聚類組中包括2份材料，分別采自福建寧德（47）和安徽繁昌（39）。第Ⅴ聚類組中包括3份材料，分別采自浙江洞頭（6）、福建福安（49）和浙江金溪（53）。第Ⅵ聚類組中只有1份材料，采自安徽金寨（42）。第Ⅶ聚類組中包括2份材料，分別采自廣西賀州（2）和湖南郴州（20）。其余的43份材料聚為第Ⅷ聚類組。對第Ⅷ聚類組的43份材料進行分析，在相似性系數為0.84的水平上，43份材料可分為6個亞組。A亞組中共有5份材料，其中3份采自湖南（11、19、32），1份采自廣西（1），1份采自江蘇（19）。B亞組中包括15份材料，其中3份采自貴州（5、7、8），3份采自廣西（24、29、27），2份采自廣東（41、40），2份采自福建（46、51），2份采自湖北（45、48），2份采自江西（31、33），1份采自浙江（4）。C亞組中包括10份材料，其中5份采自湖南（10、25、21、12、14），3份采自江蘇（15、16、17），1份采自福建（52），1份采自安徽（44）。D亞組中只有1份材料，采自湖北黃石（30）。E亞組包括8份材料，其中2份采自廣西（3、28），2份采自福建（38、50），3份采自廣東（34、37、36），1份采自湖北（35）。F亞組包括4份材料，其中3份采自江西（13、22、26），1份采自陜西（23）。聚類結果顯示，不同地區的材料具有一定的相似性，聚為一組。相同地理來源的材料遺傳變異較大，供試材料與其最初的地理來源及地理分布并不存在明顯的相關性。

3 討論

本研究利用表型性狀和SSR標記研究了53份五節芒的遺傳多樣性。結果表明，這53份五節芒在表型性狀水平和DNA分子水平上均具有豐富的遺傳多樣性。表型性狀是基因和環境共同作用的結果，本研究將不同地理來源的五節芒種植于同一地點（湖南農業大學芒屬植物種質資源圃），使其生長在相同生境下，消除環境飾變的影響，以了解由基因決定的表型性狀的變異情況。但基于表型性狀數據的聚類結果與SSR標記聚類結果并不完全一致。造成這一結果的原因可能是：1）表型性狀的檢測水平有限，特別是一些數量性狀呈連續變化，很難將不同的材料分類。2）表型性狀包括形態性狀、生理性狀、生殖性狀等方面，范圍十分廣泛，本研究所選取的25個表型性狀，只能在一定程度上揭示其表型多樣性。3）本研究所選SSR引物并不能揭示整個基因組的變異情況，且有些發生在DNA水平的變異不一定造成表型性狀的改變，比如內含子的變異。53份五節芒遺傳相似性系數在0.693 2～0.965 9，遺傳多樣性指數 H＝0.258 7，Shannon信息指數I＝0.400 4。結果表明，SSR分子標記可用于五節芒遺傳多樣性分析，53份五節芒在DNA水平上具有豐富的遺傳多樣性。

SSR分子標記因其具有大量的等位差異，多態性十分豐富，目前已廣泛應用于多種植物的遺傳多樣性研究中［16－22］。而且SSR標記具有一定的通用性，Peakall等［23］研究了31對大豆（Glycine max）SSR 引物在屬內和屬間的通用性，結果表明SSR引物通用性僅限于屬內種間和親緣關系較近的屬間。本研究中所選33對玉米和甘蔗SSR引物中有26對在五節芒中有多態性。26對多態性引物共擴增81條DNA帶，平均每對引物擴增3.12條DNA帶，其中多態性條帶74條，多態性比率為91.36%，多態性信息含量（PIC）范圍為0.086～0.374，平均為0.245。表明玉米和甘蔗SSR引物在五節芒中有較高的通用性。

刁英等［13］曾對ISSR和SRAP兩種分子標記在五節芒中的分析效率進行了研究，兩種標記的遺傳多樣性指數、Shannon信息指數、多態條帶比率分別是0.297 4、0.452 5、95.15%和0.186 6、0.301 8、84.97%。吳安迪等［14］，刁英等［13］均利用ISSR分子標記分別對五節芒進行分析，獲得的五節芒遺傳相似性系數分別為0.467 3～0.831 8和0.67～0.95。以上結果表明，如果供試材料不同或者所用遺傳標記不同，所獲得的五節芒遺傳多樣性的結論會存在一定的差異。因此，為更準確地了解五節芒的遺傳變異情況，應用不同的遺傳標記對五節芒進行分析是有必要的。

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