祁連山不同海拔梯度山生柳遺傳多樣性的SSR分析

郭敏，馬彥軍，李毅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR，simple sequence repeat）由Moore等于1991年創(chuàng)立，是一類由幾個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長(zhǎng)度一般較短，每單元長(zhǎng)度在1～6bp，兩邊有保守的DNA序列［1］。SSR具有很多優(yōu)點(diǎn)，它具有高度的多態(tài)性，數(shù)量豐富、信息含量高和重復(fù)性好等特點(diǎn)，遵循孟德?tīng)柕倪z傳規(guī)律同時(shí)具有共顯性的模式，而且對(duì)DNA的純度要求不高，這就大大減少了工作的復(fù)雜度。并且SSR標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組，呈現(xiàn)多基因特點(diǎn)，表現(xiàn)為共顯性遺傳［2－5］。

需要引起注意的是在SSR引物的獲得途徑中，由于目前只建立了DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，因此對(duì)于其中大多數(shù)的物種獲取SSR引物是比較困難的，對(duì)于一些以往處于初步研究的樹(shù)種可以借鑒其近緣種甚至其他物種已開(kāi)發(fā)的引物［6］，如柑橘屬（Citrus）的不同種［7］以及獼猴桃屬（Actinidia）的不同種的引物開(kāi)發(fā)［8］。本試驗(yàn)中首先通過(guò)楊樹(shù)（Populus）引物在柳樹(shù)（Salix）上的通用性探究旨在加速楊柳樹(shù)種遺傳育種學(xué)的研究進(jìn)程。

山生柳（Salix oritrepha）為楊柳科柳屬多年生落葉直立小灌木，為我國(guó)特有種，主要分布于海拔3 000～3 700m的高山山脊、山坡、溝谷林緣，具有生長(zhǎng)快，無(wú)病蟲(chóng)害等特點(diǎn)［9］，山生柳不僅具有以灌護(hù)草、以灌育草的作用，還能有效控制水土流失、涵養(yǎng)水源、培育土壤，對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有著重要作用［10］。目前國(guó)內(nèi)在分子方面對(duì)祁連山不同海拔梯度高寒植物的遺傳多樣性分析未見(jiàn)報(bào)道。因此本課題組在已進(jìn)行的研究中，對(duì)祁連山脈的山生柳資源進(jìn)行了較多研究，并對(duì)分布于祁連山西水生態(tài)站的山生柳進(jìn)行了梯度式考察取樣并作了細(xì)致的群落調(diào)查［11，12］。本試驗(yàn)試圖通過(guò)從楊樹(shù)引物中篩選適合山生柳的引物并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立山生柳SSR標(biāo)記的反應(yīng)體系和條件，分析山生柳的遺傳多樣性，為山生柳的進(jìn)一步研究提供依據(jù)，并為保護(hù)和發(fā)展祁連山高寒植被提出科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取樣方法和SSR引物來(lái)源

本研究選擇山生柳分布較為廣泛的祁連山自然保護(hù)區(qū)西水生態(tài)站作為實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，該區(qū)極端最高氣溫40℃，極端最低氣溫－35℃，年降水量400.8mm，集中在6－9月，空氣相對(duì)濕度58%，年蒸發(fā)量3 878mm，平均日照時(shí)數(shù)2 879.8h，無(wú)霜期平均187d。該區(qū)土壤和植被因氣候差異而形成明顯的垂直分布帶，山地森林灰褐土和亞高山灌叢草甸土是森林適宜生長(zhǎng)的土壤，山地森林灰褐土分布在海拔2 400～3 300m地帶，是喬木林的主要分布帶，混雜有山生柳。亞高山灌叢草甸土分布在海拔3 300～3 900m地帶，是山生柳的主要分布帶。

取樣時(shí)，首先在海拔2 800～3 500m范圍內(nèi)設(shè)樣線，在各樣線上沿海拔梯度平均每50m設(shè)置16m×16m的樣地1塊，共9個(gè)樣地。然后在各樣地內(nèi)，對(duì)山生柳進(jìn)行取樣。每個(gè)梯度隨機(jī)采20個(gè)無(wú)病害的葉片作樣方，共9個(gè)海拔梯度，180個(gè)單株（表1），隨著海拔的升高，山生柳的形態(tài)也有顯著變化。引物來(lái)源（http：／／www.ornl gov／sci／ipgc／ssr＿resource.htm，USA），隨機(jī)抽取合成。采用改良后的CTAB法提取植物 DNA［13］，－20℃下保存。于2009年6月－2010年6月進(jìn)行了研究。

表1 材料來(lái)源及生境特點(diǎn)Table 1 The origin of examined plants and their habitat characteristics

1.2 PCR擴(kuò)增和成果檢測(cè)

PCR程序采用優(yōu)化后的山生柳20μL體系，其中含有2.5mmol／L Mg2＋1μL，0.10mmol／L濃度的dNTPs 1.5μL，0.5UTaq酶用量為1μL，20ng／μL DNA模板1μL，0.5μmol／L的上下游引物各2μL，10×Taq Buffer 2μL、ddH2O加至20μL。PCR的預(yù)擴(kuò)增程序經(jīng)優(yōu)化后，94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，54℃（不同引物有不同的退火溫度）退火45s，72℃延伸30s，循環(huán)數(shù)30個(gè)，最后再72℃延伸10min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（200V穩(wěn)壓，2h）分離，銀染檢測(cè)［14］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

根據(jù)電泳結(jié)果，本研究用Amersham Pharmacia Biotech公司的Image Scanner電泳掃描分析對(duì)凝膠進(jìn)行掃描，根據(jù)共顯性分子標(biāo)記基因型分型的原則，對(duì)得到的圖譜進(jìn)行分析。有帶記為1，無(wú)帶記為0［15］，采用Popgen 32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，該軟件的優(yōu)點(diǎn)是處理的數(shù)據(jù)量大，適合于等位酶數(shù)據(jù)處理也適合于SSR的數(shù)據(jù)處理，因?yàn)樗芙o出所研究的各群體之間的一些資料，如：多態(tài)位點(diǎn)百分率，群體間的遺傳距離及遺傳一致度等。

2 結(jié)果和分析

2.1 山生柳SSR擴(kuò)增引物的篩選

通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增的各個(gè)引物結(jié)果進(jìn)行直觀比較從而篩選出15條帶型穩(wěn)定，重復(fù)性高的最佳引物。利用這15對(duì)引物對(duì)山生柳的遺傳多樣性進(jìn)一步分析。15個(gè)引物，共擴(kuò)增出211條條帶，分子量50～2 000bp，不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性帶紋數(shù)目從8到22不等，形成了帶型豐富、片斷大小及其組合不同的電泳圖譜（圖2和圖3）。其中多態(tài)性條帶有176個(gè)，這說(shuō)明了山生柳具有較高的遺傳多樣性。楊屬引物的多態(tài)性比例達(dá)到76.41%。47對(duì)引物中，有43對(duì)帶型穩(wěn)定清晰，通用性達(dá)91.1%（圖1），楊樹(shù)引物的多態(tài)性比例較好（表2），引物WPMS15的多態(tài)性比率達(dá)到了90%，而引物SHUKl23、SHUKl24、SHUK034的多態(tài)性比率甚至達(dá)到了100%。結(jié)果證明了楊屬植物的引物在山生柳SSR－PCR體系建設(shè)中通用性良好。

圖1 引物1～47為待篩選楊樹(shù)引物的擴(kuò)增Fig.1 Primer 1－47for populus primer which were selected

表2 選用15對(duì)引物擴(kuò)增的譜帶信息Table 2 The information on bands generated by 15SSRs

2.2 山生柳不同海拔梯度的遺傳多樣性分析

通過(guò)Popgen32計(jì)算得出的結(jié)果顯示各海拔梯度的shannon指數(shù)（I）的多態(tài)性在0.234 2～0.598 8，平均為0.419 2。Nei指數(shù)在0.146 0～0.434 2（表3），平均為0.279 6，2種指標(biāo)都表明山生柳種群具有較高的遺傳多樣性［16］，而且隨著海拔梯度的升高遺傳多樣性呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。不同海拔梯度間的Gst和Nm，總的遺傳多樣性Ht＝0.282 2，種群內(nèi)遺傳多樣性 Hs＝0.255 8，Gst＝0.093 5，即9.35%的遺傳變異存在在居群間，90.55%的遺傳變異存在居群內(nèi)（表4）。不同引物其遺傳分化系數(shù)所占的比例不同，其中ORPM－030最高，占到25.39%，引物SHUK034最低，為4.64%（表4）。基于種群間遺傳分化系數(shù)計(jì)算的基因流為Nm＝4.848 7＞1，這說(shuō)明居群間有較高水平的基因流，足以防止遺傳漂變所導(dǎo)致群居間的遺傳分化。圖2和圖3顯示了不同引物在山生柳擴(kuò)增中的多態(tài)性，不同引物形成了8～22的帶型豐富及重復(fù)性好的電泳圖譜。同時(shí)觀察到楊樹(shù)引物能很好的顯示物種的遺傳分化情況，可以方便的鑒定物種的遺傳多樣性。

表3 甘肅祁連山不同海拔梯度山生柳的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity analysis of different latitudes of S.oritrepha

圖2 引物ORPM－030在不同海拔山生柳中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 SSR amplification results of S.oritrepha with primer ORPM－030

2.3 山生柳不同海拔梯度的遺傳距離和遺傳一致度

9個(gè)海拔梯度具有較高的遺傳一致度平均為0.943 7（表5），其中海拔梯度P9和P8相似系數(shù)最高，為0.999 7，海拔梯度越高，遺傳多樣性越高，具有較多相同的遺傳物質(zhì)。9個(gè)海拔梯度的遺傳距離平均為0.029 6，海拔梯度P8和P9的遺傳距離最小，同樣說(shuō)明高海拔的山生柳就有較高的遺傳多樣性。

表4 甘肅省祁連山不同海拔梯度山生柳種群的遺傳分化Table 4 Genetic differentiations among nine altitudes of S.oritrepha

表5 不同海拔梯度山生柳遺傳一致度和遺傳距離Table 5 Genetic identity and distance between different altitude of S.oritrepha

2.4 山生柳9個(gè)不同海拔的聚類分析

根據(jù)種群間的遺傳距離，采用類平均法（UPGMA）對(duì)9個(gè)種群進(jìn)行聚類繪圖（圖4），大體分為3類群，P2首先和P3相聚，再與P1，P5相聚為一類。P6和P7相聚再與P4聚為第2類群，最后P8與P9聚為第3類群。Mantel檢驗(yàn)結(jié)果表明，遺傳距離與空間地理距離有顯著相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

3.1 楊柳引物擴(kuò)增的通用性

在SSR標(biāo)記中多態(tài)性非常高，信息量豐富，而引物的變異度大，只要開(kāi)發(fā)出合適的特異引物，檢測(cè)分析就變得簡(jiǎn)單易行，因而SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析中有很高的應(yīng)用價(jià)值［17，18］。但SSR標(biāo)記兩端序列保守，所以設(shè)計(jì)的引物必須考慮與兩端保守序列互補(bǔ)［19］，這使SSR標(biāo)記的進(jìn)行有一定的困難［20］?，F(xiàn)有的SSR標(biāo)記數(shù)量有限，所以不能標(biāo)記所有的功能基因，為了對(duì)某種植物進(jìn)行SSR標(biāo)記，就必須設(shè)立與該植物或相近物種的特定引物［21］。楊樹(shù)作為林木中的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種，成為第3個(gè)完成基因組測(cè)序的物種，所以其SSR引物應(yīng)充分被利用。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)楊柳引物通用性的探究，不僅可以有效彌補(bǔ)柳樹(shù)分子標(biāo)記不足的現(xiàn)狀，替代在柳樹(shù)中重新開(kāi)發(fā)標(biāo)記，節(jié)約引物開(kāi)發(fā)成本，而且豐富其標(biāo)記的數(shù)量。今后可在柳樹(shù)SSR實(shí)驗(yàn)上采用楊屬引物，從而節(jié)省時(shí)間和成本。尤其本實(shí)驗(yàn)中引物SHUKl23、SHUKl24、SHUK034的多態(tài)性比率達(dá)到了100%，充分證明了楊柳引物的通用性很好。

圖4 甘肅祁連山9個(gè)海拔梯度山生柳種群的遺傳聚類圖Fig.4 Dendrogram of nine latitudes of Gansu S.oritrepha

3.2 山生柳不同海拔居群的遺傳分化

通過(guò)SSR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示山生柳具有較高的遺傳多樣性，多態(tài)性條帶比率在50%以上被認(rèn)為遺傳多樣性是豐富的［22］。表明該物種還未產(chǎn)生自交衰退現(xiàn)象。當(dāng)種群Nm＞1時(shí)，存在一定的基因漂流，它能足以抵制遺傳漂變導(dǎo)致群居間的遺傳分化。在本試驗(yàn)中，Wright［23］認(rèn)為當(dāng)Nm＝4.8487＞1，屬于較高水平，說(shuō)明不同居群間存在一定的基因流動(dòng)，可以防止由遺傳漂變引起的亞種群之間的遺傳分化，其可能為：1）山生柳具有有性繁殖與無(wú)性繁殖的雙重性，北方風(fēng)沙大，花粉與種子可以隨處傳播。2）其種群有著一定的克隆生長(zhǎng)，一定年齡的基株（個(gè)體）可形成多個(gè)克隆分株，進(jìn)而構(gòu)成高寒灌叢平。根據(jù)結(jié)果顯示隨著海拔梯度的升高，山生柳的遺傳多樣性有所增大，這可能與一定的氣候，溫度相關(guān)聯(lián)。

在群落中，由于生境梯度與物種的生物學(xué)特征的不同，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)：1）群落中物種交錯(cuò)重疊，呈現(xiàn)極為復(fù)雜的關(guān)系。2）群落中物種相互不發(fā)生交錯(cuò)關(guān)系，呈現(xiàn)明顯的分布界限。3）群落中某一個(gè)或幾個(gè)物種生態(tài)適應(yīng)性較寬一些，但是其他物種（或類型）由于生境梯度的急劇變化，而被嚴(yán)格限制在某種生境中［24］。在聚類圖4中出現(xiàn)了一定情況的交錯(cuò)現(xiàn)象，說(shuō)明在一定海拔處呈現(xiàn)出明顯的生態(tài)交錯(cuò)區(qū)。保護(hù)現(xiàn)存自然種群以保存盡可能多的遺傳多樣性是適宜的保護(hù)措施［25］，生境適宜促進(jìn)物種進(jìn)化，有利于物種長(zhǎng)期生存發(fā)展，從另一方面證明山生柳對(duì)高寒氣候的適應(yīng)性很強(qiáng)，這也是本試驗(yàn)在不同海拔對(duì)山生柳遺傳多樣性進(jìn)行探究的目的所在。根據(jù)計(jì)算得到的不同海拔梯度 Ht＝0.282 2，Hs＝0.255 8，Gst在0.046 4～0.253 9，平均為0.093 5，即4.64%～25.39%的遺傳變異存在于居群間，74.76%～95.26%的遺傳變異存在于居群內(nèi)。山生柳以有性繁殖為主，但是，由于山生柳分布于寒帶氣候如：高山、亞高山、山地寒溫針葉林帶和冰雪帶之間，具有長(zhǎng)期積雪、風(fēng)大、低溫、干燥等氣候特點(diǎn)。因此，在惡劣的環(huán)境下，山生柳有性繁殖受到極大限制，因而主要依靠無(wú)性繁殖來(lái)維持其穩(wěn)定。

山生柳聚類分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察特征基本一致，即說(shuō)明了遺傳本質(zhì)差異對(duì)外部形態(tài)特征的對(duì)應(yīng)反應(yīng)［26］。從另一方面證實(shí)SSR標(biāo)記穩(wěn)定可靠，可以利用標(biāo)記進(jìn)行物種的遺傳多樣性的分析。在祁連山脈隨著海拔的升高呈現(xiàn)出錦雞兒和山生柳叢生的情況，個(gè)體數(shù)較多也有利于傳粉和繁殖，干擾少?gòu)亩Y源保護(hù)很好，山生柳自身在惡劣的環(huán)境下積累了較多的遺傳變異，以適應(yīng)各種環(huán)境變異，例如隨著海拔的升高山生柳葉片蠟質(zhì)增多，葉片變小而厚等。上述結(jié)果均表明，群體分布的海拔和緯度差異，一定程度上造成了天然山生柳的分化。同時(shí)在本次研究中，也存在一定的限制性因素，由于取樣范圍有限，今后的研究中應(yīng)擴(kuò)大采集樣地，如甘肅省的山丹、蘇南、榆中、青海和四川［27］，力求進(jìn)一步揭示山生柳種群生態(tài)學(xué)特征及其遺傳多樣性。

結(jié)合本研究的結(jié)果建議從以下幾方面對(duì)山生柳資源進(jìn)行保護(hù)：1）就地保護(hù)好現(xiàn)有資源，禁止破壞生境，防止過(guò)度的放牧導(dǎo)致山生柳銳減，維護(hù)好小環(huán)境，建立自然保護(hù)區(qū)，對(duì)山生柳進(jìn)行監(jiān)護(hù)。2）今后擴(kuò)大采樣范圍，從分子方面探討山生柳遺傳漂變對(duì)其分布的影響。進(jìn)一步揭示山生柳的遺傳多樣性。3）利用組織培養(yǎng)和扦插繁殖擴(kuò)大其栽培面積，最大效益的實(shí)現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)，生態(tài)價(jià)值。

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