HMGB1基因真核細胞表達載體的構建及其在人臍靜脈血管內皮細胞中的表達

張曉娟，李旭，欒正剛，馬曉春

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，沈陽 110001）

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應綜合征，其發(fā)生率以每年1.5%～8%的速度遞增［1］。高遷移率族蛋白 1（high mobility group box 1，HMGB1）是高遷移率族蛋白超家族成員之一，是廣泛存在于真核細胞核中最重要的非組蛋白，分子質量小，含量豐富，序列高度保守［2，3］。HMGB1 是膿毒血癥晚期重要的炎性介質［4］。血管內皮細胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，當其受到炎性刺激時可釋放HMGB1，促進細胞因子和黏附分子的表達［5，6］。HMGB1激活血管內皮細胞的分子機制尚未明確。本研究旨在構建HMGB1基因真核細胞表達載體，并鑒定重組質粒轉染到細胞中后HMGB1蛋白的表達，為HMGB1基因在膿毒癥發(fā)病機制和細胞信號的研究提供有利的分子工具。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞和質粒

人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical venular endothelial cell，HUVEC）株購自南京凱基生物公司，PCDNA-3.1-myc-his-B質粒和大腸桿菌DH5α購自大連TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

High-glucose DMEM、胎牛血清購于Hyclone公司；KpnⅠ、EcoRⅠ限制性內切酶﹑T4 ligase DNA連接酶﹑氨芐青霉素100 mg/mL﹑瓊脂糖凝膠﹑DL2000 DNA Marker﹑HindⅢ-digest DNA Marker﹑RT-PCR 試劑盒均購自TaKaRa公司；Trizol購自Invitrogen公司；兔抗His標簽抗體購自Santa Cruze公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自中杉公司，小提質粒試劑盒、凝膠回收試劑盒購自于愛思進公司。引物合成、DNA測序鑒定由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 載體構建：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)HUVEC至90%融合，Trizol法提取總RNA，反轉錄為cDNA，PCR擴增HMGB1的可讀框。用Primer5.0軟件設計引物，上游和下游分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點，引物序列如下：上游：5′-GGGGTACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAGA-3′；下游 ：5′-CGGAATTCGTTTCATCATCATCATCTTCTTC-3′。擴增條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72℃50 s，循環(huán)30次。擴增長度為647 bp，將PCR產物和PCDNA-3.1-myc-his-B用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切，電泳后切膠回收。T4連接酶16℃連接16 h，轉化感受態(tài)DH5α，以含氨芐青霉素的LB選擇性固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日挑取陽性克隆，提取質粒，酶切鑒定，然后測序。

1.2.2 提取無內毒素重組載體：將酶切陽性且測序結果吻合的菌液接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌液，采用無內毒素質粒中提試劑盒，按照說明書抽提無內毒素重組體。

1.2.3 質粒轉染：收獲處于對數生長期的HUVEC，以 5×104/孔接種于 6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細胞長至80%～90%融合，按轉染試劑說明書進行轉染。將細胞分為陰性對照組（轉染PCDNA-3.1-myc-his-B空載體）和實驗組（轉染PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒）。轉染48 h后收集RNA和蛋白進行相應的檢測。

1.2.4 Western blot：PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒轉染HUVEC 48 h后，提取轉染后細胞的總蛋白，考馬斯亮蘭定量，將樣品調成相同的濃度，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮5 min，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，將膜與一抗（兔抗His標簽抗體1︰500稀釋）4℃孵育過夜，PBST洗膜，再與辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育1 h，PBST洗膜，將膜與ECL發(fā)光底物結合，曝光，顯影。

2 結果

2.1 瓊脂糖電泳結果

1%瓊脂糖電泳結果顯示，PCR反應產物大小為647 bp，與GenBank中登錄的人HMGB1基因大小一致。見圖1。

2.2 PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒的的雙酶切鑒定

提取PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒，經KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切，電泳結果如圖2所示，重組質粒酶切后產生5 500 bp與647 bp 2個條帶，分別與PCDNA-3.1-myc-his-B和HMGB1基因大小相符，初步確定PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒構建成功。

2.3 PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒測序結果分析

提取PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒，經上海生工生物公司測序，結果與GenBank中HMGB1序列比對，完全一致，無移碼，無突變，確定重組質粒構建成功。

2.4 蛋白水平檢測PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒在HUVEC中的表達

PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質粒轉染HUVEC 48 h后，提取細胞總蛋白做Western blot檢測，與PCDNA-3.1-myc-his-B空載體轉染細胞組相比，外源重組蛋白HMGB1在PCDNA-3.1-myc-his-BHMGB1重組質粒轉染組HUVEC內有表達。見圖3。

3 討論

HMGB1是一種普遍存在的核蛋白，廣泛分布于哺乳動物細胞中，在胸腺、淋巴組織、睪丸和新生兒肝臟中均可檢測到高水平的HMGB1［7］。不同存在部位的HMGB1可發(fā)揮不同的生物學功能及效應：細胞核內的HMGB1為DNA結合蛋白，能維持核小體結構，調節(jié)基因轉錄及類固醇類激素受體的活性；胞外HMGB1為一種重要的炎性介質和致炎細胞因子，是啟動和維持炎癥瀑式反應的中心分子，與膿毒癥的發(fā)病機理關系密切［8］。胞外HMGB1需要與相應胞膜受體結合才能發(fā)揮其生物學效應，晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）與HMGB1具有高親和力，是HMGB1的主要受體［9］，HMGB1與RAGE結合后，可引發(fā)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的磷酸化（包括 p38MAPK、JNK1/2、ERK1/2），核轉錄因子 NF-κB 和活化蛋白 1的核內轉移，使其他炎性因子如IL-1β、TNF-α及IL-8等表達加強，釋放增多，從而啟動炎癥或使炎癥惡化［10］。膿毒癥時，RAGE在內皮中廣泛表達，提示HMGB1可能對血管內皮細胞有激活作用，并且促成了對感染的炎性反應。然而，RAGE不應是HMGB1的唯一受體，近期研究結果顯示，Toll樣受體 2（toll like receptor 2，TLR2）和 4（TLR4）可能也作為HMGB1的受體參與HMGB1的信號轉導［11］。前期的研究證實，HMGB1可由激活的內皮細胞釋放，促進細胞因子和黏附分子的表達增加。內皮可能是HMGB1分泌的重要源泉［12］。本研究應用PCR方法從HUVEC中擴增HMGB1全長基因，酶切后定向克隆到帶有HIS標簽的真核細胞表達載體PcDNA3.1中，酶切測序鑒定質粒構建成功；再將質粒轉染到HUVEC中，Western blot檢測到HMGB1在HUVEC中與轉染空載體組對比呈高表達。本研究結果為進一步探索HMGB1在膿毒癥血管內皮細胞損傷或激活中的作用提供了一種新的研究工具。

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