參附注射液對(duì)腦缺血再灌注大鼠MDA、SOD、TXB2及6-keto-PGF1a的影響及意義

江承平，劉福，李毅，王柏強(qiáng)，唐曉蓉，吳碧華，王曉明

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 63 700 7；2.川北醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)研究所，四川 南充 63 7000）

近年來(lái)腦缺血后繼發(fā)性損傷、炎性反應(yīng)對(duì)腦缺血后神經(jīng)功能缺損及致殘率方面的作用逐漸引起重視。雖然人們更傾向于超早期溶栓治療腦梗死，但是腦缺血再灌注損傷引起的一系列繼發(fā)改變，導(dǎo)致缺血組織損傷惡化。研究發(fā)現(xiàn)，某些中藥如川芎、參附等可以減輕腦缺血再灌注的損傷，但目前國(guó)內(nèi)這方面的具體研究極少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察參附注射液對(duì)局灶性腦缺血-再灌注大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）、血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素 F1a（6-keto-PGF1a）含量的影響，探討參附注射液對(duì)腦的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

參附注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，10 mL/支（批號(hào)為：991202）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、血檢素B2（TXB2）及6-酮-前列腺素Fla（6-keto-PGF1a）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），Amresco 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。低溫離心機(jī)，美國(guó)Beckman TJ-6Centrfuge；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立：健康雄性成年SD大鼠60只，體質(zhì)量240～270 g（清潔級(jí)）購(gòu)自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（川2008-18）。實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1周。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組（IR組）、參附治療組，每組20只。動(dòng)物術(shù)前12 h禁食不禁水，參照Longa［1］及改良線(xiàn)栓法［2］制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，用2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1腹腔內(nèi)注射，麻醉后分離頸部各動(dòng)脈，將直徑0.20 mm尼龍線(xiàn)，自右頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至遇阻力為止，深度約為18 mm（自頸總動(dòng)脈分叉處算起），注意防止栓線(xiàn)滑出，結(jié)扎固定栓線(xiàn)，術(shù)中監(jiān)測(cè)直腸溫度，保持在36.5～37.5℃。缺血2 h后，在麻醉狀態(tài)下，拔出栓線(xiàn)，再灌注24 h，以大鼠蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner征，爬行向左側(cè)劃圈或左前肢屈曲為模型建成的標(biāo)志。假手術(shù)組只進(jìn)行麻醉和血管分離術(shù)，不進(jìn)行缺血再灌注及靜脈注射；參附治療組于再灌注后經(jīng)靜脈給參附注射液8 mg/kg（生藥濃度），7 d，IR組于再灌注后經(jīng)靜脈給予生理鹽水 8 mg/kg，7 d。

1.2.2 神經(jīng)功能缺失評(píng)分：按 Longa［1］及 Bederson［3］5分制法對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀體征；1分，對(duì)側(cè)前爪不能完全伸直，同側(cè)Horner征；2分，行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自行行走，意識(shí)喪失。

1.2.3 腦梗死面積測(cè)定［4］：各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束，迅速斷頭取腦，置于-20℃冰箱中冷凍20 min，距額極后2.5 mm，冠狀面切取腦片5張，將切片迅速置于2%TTC溶液中，避光，37℃溫孵15～30 min，不時(shí)翻動(dòng)切片，使均勻接觸染色劑，正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。然后置于4%多聚甲醛中固定，將染色結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，利用圖像處理軟件（AutoCAD），分別計(jì)算出5個(gè)腦片缺血側(cè)的總面積和梗死區(qū)域的面積，求出梗死區(qū)域占大腦半球總面積的百分比作統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.2.4 腦組織 SOD、MDA、TXB2、6-Keto-PGF1a 水平測(cè)定：各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束，迅速斷頭取腦，腦組織于冰浴中分離大腦皮層，稱(chēng)取200 mg，冷PBS液10 mL勻漿，-20℃?zhèn)溆茫瑴y(cè)定時(shí)樣本作適當(dāng)稀釋。采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清中SOD活性（單位：U/mL）；硫代巴比妥酸顯色法（TBA法）檢測(cè)血清中MDA含量（單位：nmol/L）；平衡法測(cè)定TXB2（單位：ng/L）；非平衡法測(cè)定6-Keto-PGF1a（單位：ng/L），操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 參附注射液對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響

假手術(shù)組的神經(jīng)功能評(píng)分為0，IR組有明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀，主要表現(xiàn)為提尾懸空時(shí)的強(qiáng)迫體態(tài)——左前肢緊貼胸壁軀體向左側(cè)扭轉(zhuǎn)，右側(cè)肌張力相對(duì)增強(qiáng)以及運(yùn)動(dòng)時(shí)的追尾征——向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，致尾巴呈特殊的盤(pán)繞狀；參附組能明顯降低模型組神經(jīng)功能缺失癥狀。見(jiàn)表1。

2.2 參附注射液對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積比的影響

TTC染色結(jié)果表明，假手術(shù)組腦片均紅染，無(wú)白色梗死灶。IR組可見(jiàn)明顯的梗死灶，主要位于嗅溝上方的顳葉皮質(zhì)和尾殼核。參附治療組與IR組比較腦梗死比顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)表1，圖1～3。

2.3 參附注射液對(duì)腦缺血再灌注大鼠SOD活性、MDA、TXB2及6-keto-PGF1a含量的影響

IR組與假手術(shù)組比較，血清中SOD活性降低，MDA、TXB2含量增加，6-keto-PGF1a含量降低（P<0.05）；參附治療組與IR組比較，血清中SOD活性增高，MDA、TXB2含量降低，6-keto-PGF1a含量增高（P<0.05）；參附治療組血清中SOD活性低于假手術(shù)組，MDA、TXB2含量高于假手術(shù)組（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

本研究從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等方面證實(shí)參附注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

3.1 改善MCAOR損傷后大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀

由于大腦中動(dòng)脈供血區(qū)涉及調(diào)控運(yùn)動(dòng)的腦區(qū)，因此動(dòng)物麻醉清醒后即可表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)失調(diào)的神經(jīng)病學(xué)癥狀，右側(cè)MCAOR，同側(cè)調(diào)控運(yùn)動(dòng)控制區(qū)發(fā)生損傷，由于皮層交叉支配，導(dǎo)致左側(cè)肢體肌無(wú)力，故運(yùn)動(dòng)時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，表現(xiàn)出典型的追尾征或向左側(cè)傾倒等癥狀。參附組的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均降低，表明該藥能改善MCAOR大鼠的神經(jīng)功能障礙。TTC染色結(jié)果顯示，參附治療組大鼠腦梗死體積百分比顯著下降，說(shuō)明參附注射液在減輕大鼠腦缺血再灌注損傷中起著重要的作用。

3.2 提高SOD的活性，降低MDA含量，維持血漿中TXB2/6-keto-PGF1a動(dòng)態(tài)平衡

MDA是氧自由基引發(fā)的生物膜不飽和脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)代謝產(chǎn)物，能夠反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度［5］，而SOD是天然抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)生成的氧自由基，從而阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，其活性能夠反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注后血清中SOD活力顯著下降，MDA含量顯著增高，說(shuō)明大鼠腦缺血再灌注后大量氧自由基的產(chǎn)生及SOD活力下降引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，使MDA含量增高。脂質(zhì)過(guò)氧化增加能夠使細(xì)胞溶解，還能引起血小板膜的損傷，促使血小板的聚集，并且會(huì)抑制動(dòng)脈壁前列環(huán)素（PGI2）合成酶活性，使得PGI2合成減少，導(dǎo)致TXA2/PGI2比例失調(diào)，引起對(duì)機(jī)體的損傷［6，7］。PGI2是血管壁內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的有舒張血管和抗血小板聚集作用的生物活性物質(zhì)，半衰期短，迅速轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的無(wú)生物活性的6-keto-PGF1a。而TXA2是血小板微粒體合成釋放的具有促進(jìn)血小板聚集和促進(jìn)血管收縮的生物活性物質(zhì)，半衰期也很短，很快轉(zhuǎn)為穩(wěn)定無(wú)生物活性的TXB2。在正常的生理環(huán)境下，PGI2和TXA2保持平衡，控制血管的正常張力，防止血栓的形成。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷時(shí)，TXB2（TXA2）增多，6-keto-PGF1a（PGI2）減少，導(dǎo)致血小板聚集和血管強(qiáng)烈收縮，導(dǎo)致低灌流，加重了腦組織的損傷，這與其他報(bào)道的結(jié)論一致［8，9］。

研究中我們發(fā)現(xiàn)，參附注射液可以顯著提供SOD的活性，使得體內(nèi)氧自由基減少，減少了氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，使MDA含量降低，表明其可減輕缺血所致的腦組織自由基損傷；同時(shí)PGI2（6-keto-PGF1a）合成增多，顯著提高TXB2（TXA2）的含量，有利于TXA2/PGI2平衡的恢復(fù)，提示參附注射液對(duì)腦缺血再灌注的損傷具有顯著的保護(hù)作用。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［2］羅勇，董為偉.Wistar大鼠插線(xiàn)法局灶性腦缺血/再灌注模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，27（1）：1-4.

［3］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-475.

［4］張均田.現(xiàn)代藥理學(xué)試驗(yàn)方法［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)，中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版聯(lián)社，1998：1241.

［5］Ikeda Y，Long DM.The molecular basis of brain injury and brain edema：The role of oxygen free radicals［J］.Neurosurgery，1990，27（1）：1-11.

［6］DurukanA，StrbianD，TatlisumakT.Rodentmodelsofischemic stroke：a useful tool for stroke drug development［J］.Curr Pharm Des，2008，14（4）：359-370.

［7］Fang YC，Wu JS，Chen JJ，et，al.Induction of prostacyclin/PGI（2）synthase expression after cerebral ischemia-reperfusion［J］.J Cerebr Blood F Met，2006，26（4）：491-501.

［8］李青蘭，任澤恩，武建坤，等.絡(luò)泰對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，22（3）：165-167.

［9］Vikram D.Effect of phospholipase C blockade on cerebral vasospasm［J］.Cerebrovasc Dis，2008，25（4）：362-365.