霍亂弧菌O139膠體金免疫層析快速檢測法的建立

王玉金，楊書豪，劉 麗，龐向宇，孫晨陽，李珊珊

霍亂（Cholera）是由霍亂弧菌（Vibriocholerae）所引起的烈性腸道傳染病，它和鼠疫、黃熱病一起，被世界衛生組織（WHO）規定為必須實施國際衛生檢疫的三種傳染病之一，在中國屬法定管理的兩種“甲類”傳染病之一。霍亂是一種重要的急性腸道傳染病，以發病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征。霍亂病原菌包括O1群和O139群。人類歷史上已有的七次霍亂大流行，均由O1群霍亂弧菌引起。自1992年起，印度和孟加拉國先后發生O139霍亂，并造成廣泛傳播，我國也有O139霍亂的爆發或輸入性病例［1］。盡早快速診斷該病原體，對于迅速控制傳染源、減少病死率具有重要意義。常規的分離技術包括增菌、培養、生化和血清學鑒定，需要時間較長，不適合口岸現場檢測。采用霍亂弧菌O139群的特異性單克隆抗體開發的膠體金試紙條，可快速、簡便、準確地檢測霍亂弧菌［2］。本研究應用雙抗體夾心法及膠體金免疫層析法制備霍亂弧菌O139群膠體金免疫層析試紙條，簡便快速，并與常規培養法結果進行對比分析，其特異性和靈敏度均較好。

1 材料與方法

1.1 材料 所有菌株均由中國醫學細菌保藏管理中心和中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所衛生部醫學分子細菌學重點實驗室提供；抗霍亂弧菌O139群單抗 由本所細胞室提供，3H2用于標記，2G8用于包被；兔抗鼠IgG由本所細胞室制備，血清雙向瓊脂擴散效價≥1∶64；氯金酸（HAuCl4·4H2O）Sigma公司產品；硝酸纖維素微孔濾膜（NC）美國Millipore公司產品。

1.2 膠體金標記物的制備

1.2.1 膠體金溶液的制備 參照文獻［3］進行。取0.01%HAuCl4水溶液100 m L，加入10 g/L檸檬酸三鈉水溶液2 m L，加熱煮沸15～30 min，直至顏色變紅，即為膠體金溶液。

1.2.2 膠體金標記的最佳p H測定 取10μg/m L單抗3H21.0 m L，分別加入1.0 m L p H 值為6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2的 膠 體 金溶液中，混勻，室溫下放置5 min；再分別加入10%NaCl溶液0.1 m L，混勻，靜置2 h后觀察結果，確定金標記最佳p H值。

1.2.3 最適標記蛋白濃度的測定 取10支試管，各加入1.0 m L膠體金溶液，將單抗3H2分別稀釋成13μg/m L、12μg/m L、11μg/m L、10μg/m L、9 μg/m L、8μg/m L、7μg/m L、6μg/m L、5μg/m L，各取1.0 m L按順序加入上述膠體金溶液中。對照管加入1.0 m L稀釋液（不含蛋白質），混勻，室溫下放置5 min；再分別加入10%NaCl溶液0.1 m L，混勻，靜置2h后觀察結果，確定最適標記蛋白濃度。

1.2.4 單克隆抗體3H2膠體金標記物的制備 參照文獻［4］。取膠體金100 m L，用0.1 mol/L K2CO3調p H值，在攪拌下快速加入單克隆抗體3H2，繼續攪拌30 min后，加入BSA至10 g/L；再繼續攪拌15 min，3 000 r/min離心5 min，棄沉淀；上清液再12 000 r/min離心15 min，小心吸棄上清液，沉淀物以p H7.0濃度為0.01 mol/L PBS－2%BSA 溶液溶解，即為膠體金標記溶液，將玻璃纖維浸泡于膠體金標記溶液中，待完全浸泡均勻后，取出干燥，即成單克隆抗體3 H2膠體金標記物。

1.3 包被膜的制備

1.3.1 包被抗體濃度的確定 純化的單抗2G8和兔抗鼠IgG分別用0.5、1、2、3、4、5 mg/m L的濃度用自動點膜機包被制備成包被膜，與同一批膠體金標記物裝配成試紙條，觀察結果，確定包被抗體的最佳濃度。

1.3.2 單克隆抗體2G8及多抗兔抗鼠IgG的包被

參照文獻［5］。分別將兩種抗體裝入兩支潔凈專用掃描筆中；設定測試帶（2G8）和質控帶（兔抗鼠IgG）寬度均為0.1 cm，二者間距為1 cm，位于NC膜中部；將程序輸入自動點膜機，進入工作狀態；按啟動鍵，開始包被，做標記符號。將包被有抗體的NC膜置p H7.0濃度為0.01 mol/L PBS－1%BSA 封閉液中37℃60 min，干燥，即為包被膜。

1.4 試紙條組裝 取潔凈PVC板，將包被膜用雙面膠固著于PVC板固定位置上；將棉漿板連接在NC膜上端，玻璃纖維連接包被膜下端；膠體金標記物附著在玻璃纖維下，與包被膜銜接；色膜覆蓋于棉漿板之上；MARK標志膜覆蓋于玻璃纖維之上；均勻、輕微滾動式推進，加強粘和力；用切割機將貼好的板切割成所需寬度的條，即為成品試紙條。

1.5 測試方法 將霍亂弧菌O139群膠體金免疫層析試紙條帶MARK標志線一端插入裝有樣品的容器中，樣品通過玻璃纖維的層析作用上行與膠體金標記物（Au－3 H2）結合形成抗原抗體（Au－3 H2－O139）復合物，再移行至包被膜上抗O139單抗（2G8）帶區，即和2G8結合，構成（Au－3 H2－O139－2G8）雙抗體夾心復合物，呈現出目測可見的紅色條帶，全部試驗過程僅需5～10min。測定結果判斷：陰性：試紙條測試帶不顯色僅質控帶顯色，出現1條紅線；陽性：試紙條測試帶和質控帶均顯色，出現2條紅線；若試紙條質控帶無紅線出現，則測試無效。1.6 膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測 用試紙條對霍亂弧菌O139群樣品、霍亂弧菌O1群、霍亂弧菌O22群、霍亂弧菌O155群、大腸桿菌、副溶血弧菌、麥氏弧菌、傷寒及各型副傷寒桿菌、糞鏈球菌、河弧菌、耶爾森氏菌、痢疾桿菌、變形桿菌、出血性大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌進行檢測試驗，試驗重復3次。

1.7 膠體金免疫層析試紙條的敏感性檢測 將霍亂弧菌O139群菌懸液系列稀釋到109cfu/m L數量級，再以樣品處理液10倍系列稀釋到1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103cfu/m L。分別用膠體金免疫層析試紙條檢測，觀察結果。

1.8 膠體金免疫層析試紙條的穩定性 將試紙條置2℃～8℃干燥保存，每月定期抽檢至第13個月，與新制備的試紙條平行檢測陽性和陰性，比較兩者的檢測結果。

1.9 臨床考核 用霍亂弧菌O139群膠體金免疫層析試紙條，與細菌培養法對比檢測臨床標本184例，以考核檢測試紙條法與細菌培養法的符合率。

2 結 果

2.1 膠體金標記的最佳p H測定 膠體金溶液p H由6.3至6.8，顏色有藍灰變成暗紅，當膠體金溶液為6.9、7.0、7.1、7.2時，免疫膠體金溶液穩定，顏色鮮艷，膠體金標記蛋白時最佳p H為6.9。

2.2 最適標記蛋白濃度的測定 含蛋白質量少不能穩定的膠體金溶液各管呈現由紅變藍聚沉現象，而加入蛋白質達到或超過最低穩定量，試管膠體金溶液則保持紅色不變。由表1得知穩定膠體金的最低蛋白量為9μg/m L，再加此量的20%即為穩定1 m L膠體金所需蛋白質（抗體）的實際用量。因此，霍亂弧菌O139群最佳標記蛋白量為每毫升膠體金中加入11μg標記單抗3H2。

表1 免疫膠體金標記蛋白用量的測定Tab.1 Optimization on the amount of antibody in labeling colloidal gold

2.3 膠體金標記溶液的最適稀釋度 分別將100 m L膠體金標記單抗3H2制備的膠體金標記沉淀物用p H7.0，濃度為 0.01 mol/L PBS－2%BSA 溶液溶解稀釋為50 m L（原體積的50%）、40 m L（原體積的40%）、30 m L（原體積的30%）、20 m L（原體積的20%），分別按0.1 m L/cm2的用量分散到玻璃纖維上，干燥后與同一批包被膜裝配成試紙條，測試結果如表2，結果表明，膠體金標記溶液采用其濃度為原體積的40%制備成的膠體金標記物，即可滿足測試要求。

2.4 包被抗體濃度的確定 測試結果如表3，結果采用2G82mg/m L、兔抗鼠IgG 4 mg/m L的包被量即可滿足所需靈敏度的要求，增加包被抗體的濃度不提高測試靈敏度。

表2 不同濃度膠體金標記物的檢測結果Tab.2 Detection results of colloidal gold with different concentrations

表3 不同包被濃度的檢測結果Tab.3 Detection results of different coating concentrations

2.5 膠體金免疫層析試紙條的特異性 用試紙條檢測霍亂弧菌樣品，結果為陽性，檢測霍亂弧菌O1群霍亂弧菌O22群、霍亂弧菌O155群、大腸桿菌、副溶血弧菌、麥氏弧菌、傷寒及各型副傷寒桿菌、糞鏈球菌、河弧菌、耶爾森氏菌、痢疾桿菌、變形桿菌、出血性大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌，全部為陰性。

2.6 膠體金免疫層析試紙條的敏感性 用試紙條檢測稀釋度1×108、1×107、1×106、1×105cfu/m L霍亂弧菌O139群樣品，在檢測線與質控線處均出現紅色條帶，表明檢測結果為陽性；而1×104cfu/m L霍亂弧菌O139群樣品檢測線處顯色可疑；1×103cfu/m L霍亂弧菌O139群樣品僅在質控線處出現明顯的紅色條帶，表明檢測結果為陰性。因此，該試紙條靈敏度為1×105cfu/m L。

2.7 膠體金免疫層析試紙條的穩定性 將試紙條置2℃～8℃干燥保存，每月定期抽檢至第13個月，與新制備的試紙條平行檢測陽性和陰性，均未發現特異性和敏感性降低。

2.8 臨床考核 用霍亂弧菌O139群膠體金免疫層析試紙條，與細菌培養法在臨床標本的對比試驗中，特異性和靈敏度均達到100%，具體數據見表4。

表4 膠體金試紙條與細菌培養法對比Tab.4 Comparison on colloidal gold immunochromatography and bacterial culture

3 討 論

免疫膠體金技術是20世紀70年代初期由Faulk和Taylor始創，最初用于免疫電鏡技術。目前金標記技術常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術用于體外快速診斷的一個重要發展方向，是在現代單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的新型檢測技術。近年來該技術發展迅速，已經在臨床診斷特別是床邊檢測（POCT）中得到了廣泛應用，如傳染病、早孕、腫瘤等的檢測。目前已有些非臨床檢測的應用，如毒素、農藥殘留、環境監測、動物源性食品的現場快速檢測［6］等。我們建立的霍亂弧菌O139膠體金免疫層析快速檢測法具有操作簡便、快速靈敏、不需儀器設備、能夠同時檢測大量樣品等優點。適用于多種食品樣品中霍亂弧菌O139的檢測，可用于出入境口岸對可疑污染食品的應急現場快速篩查。進一步提高免疫層析試驗的敏感性、實現多元檢測、實現定量或半定量檢測是我們今后努力的方向。

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沈關心，周汝麟.現代免疫學實驗技術［M］.武漢：湖北科學技術出版社，1998：131－137.

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［6］Qi GY，Zhi XY，Ren WW，et al.Application progress of colloidalgold immunochromatographic assay（GICA）in animalderived food［J］.J Northeast Agri Univ，2010，41（4）：156－160.（in Chinese）

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