廣西空腸彎曲菌和結腸彎曲菌流行病學調查＊

林 玫，周凌云，王鳴柳，廖和壯，黃 君，農志新，農良偉，梁大斌，權 怡，方錦嵩，張茂俊

2.大興區CDC，南寧 532300；

3.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206

彎曲菌是重要的食源性人獸共患病原菌，可引起動物腹瀉、流產，以及人類急性腸炎、格林巴利綜合征、反應性關節炎、Reiter’s綜合征等多種疾病，其中引起人類致病最多見的是空腸彎曲菌和結腸彎曲菌［1－2］，近年隨著國內外學者對其研究的深入，越來越顯示出其引起的腹瀉所導致的日益加重的疾病負擔［3］。為了解廣西兩種彎曲菌所引起腹瀉的流行病學特點以及在健康人群和動物中的攜帶狀態，為該病防治提供依據，我們于2008－2010年在廣西崇左市大新縣和南寧市開展了腹瀉病人群、健康人群、重點人群和食品等調查，現將結果分析如下。

1 材料與方法

1.1 流行病學調查

1.1.1 腹瀉病例調查 2008年9月－2010年12月期間，在崇左市大新縣的縣人民醫院、婦幼保健院、中醫院、疾病預防控制中心門診等4所醫院、3所鄉鎮衛生院、3所個體診所以及南寧市2所醫院（廣西婦幼保健院及南寧市第一人民醫院），對就診的符合感染性腹瀉病例定義的患者進行個案調查和采樣。共采集糞便標本677份分別送大新縣疾病預防控制中心（以下簡稱大新縣CDC）和廣西疾病預防控制中心（以下簡稱廣西CDC）實驗室進行分離培養，大新縣CDC所檢出的陽性標本送至廣西CDC實驗室進行復核和進一步檢測。

1.1.2 健康人群調查 2008年9月－2009年3月間，在大新縣調查5歲以下健康人群共121名，按6－12月、1－2歲、2－5歲共分3個年齡組，每組分別采集了37、38、46名健康人群（半個月內未患過腹瀉者）共121份糞便標本，送廣西CDC實驗室進行檢測。

1.1.3 從業人員攜帶狀況調查 2009年9月在大新縣某養豬場隨機采集豬飼養員糞便標本11份、食品公司屠宰廠職工糞便標本21份共32份糞便標本，送廣西CDC實驗室進行檢測。

1.1.4 動物攜帶情況調查 2009年9月分別在大新縣某養豬場、大新縣某養雞場、南寧市某養雞場、南寧市某市場售活雞攤位共隨機采集豬糞便標本50份、雞糞便標本105份，送廣西CDC實驗室進行檢測。

1.2 實驗室檢測

1.2.1 空腸彎曲菌和結腸彎曲菌分離培養 用棉拭子沾取糞便涂于CCDA平板，再用接種環劃線分離培養。42℃微需氧培養48 h觀察可疑菌落。初步鑒定：菌落形態為菌落灰色、扁平、濕潤、有金屬光澤，似可穎菌落，直徑1～2 mm，邊緣完整、發亮。如無可疑菌落可繼續培養5～6 d。挑取可疑菌落，轉劃哥倫比亞血平板進行分純，對血平板上的菌落，一是直接進行PCR檢測；二是進行革蘭染色鏡檢，如為革蘭氏陰性菌，螺旋形，彎曲桿狀，呈S形、海鷗狀或逗點狀，則接種API生化試劑條進行系統生化鑒定。研究中使用的陽性對照菌株—空腸、結腸彎曲菌標準菌株由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所惠贈；以鼠傷寒沙門菌作為陰性對照菌株。1.2.2 PCR和脈沖場凝膠電泳分型

1.2.2.1 單管二重PCR鑒定空、結腸彎曲菌 空腸彎曲菌引物序列：jun1 5′－CATCTTCCCTAGTCAAGCCT－3′，jun2 5′－AAGATATGGCACTAGCAAGAC－3′；結腸彎曲菌引物序列：Col1 5′－AGGCAAGGGAGCCTTTAATC－3′，Col2 5′－TATCCTATCTACAAATTCGC－3′。取滅菌超純水制備200μL菌懸液，將其置于干式恒溫器上100℃加熱10 min，然后于12 000 r/min離心10 min，取上清液分裝Eppendorf管，作為擴增反應的DNA粗制模板。反應總體系為25μL，體系中含d NTP Mixtures各0.4 mmol/L，10×Buffer 2.5μL，Ta KaRa Taq1.25 U，引物各10μmol/L，細菌DNA粗制模板1μL。

PCR 循環參數：94℃預變性5 min，94℃1 min、59℃1 min、72℃1 min循環35次，72℃延伸5 min，然后取擴增產物5μL在1%瓊脂糖凝膠上電泳，用Gel Doc XR凝膠成像系統照像。

1.2.2.2 脈沖場凝膠電泳分型方法按照Pulse Net China對空腸彎曲菌進行PFGE分子分型的快速標準實驗室規程操作。

1.3 數據統計分析 采用Excel表格進行數據錄入，用Epi info軟件進行統計分析。

2 結 果

2.1 檢出的菌株及陽性率 從采集的985份檢材中共培養分離到21株彎曲菌。經對以上菌株用空腸彎曲菌、結腸彎曲菌特異性引物進行PCR擴增，獲得空腸彎曲菌11株、結腸彎曲菌10株。彎曲菌總的檢出率為2.13%，其中空彎和結彎檢出陽性率分別為1.12%和1.02%，兩者差異無統計學意義（P＝1.000），見表1。

表1 各群組中彎曲菌檢出總表Tab.1 Campylobacter positive rate in all groups

2.2 腹瀉病例調查 對677例腹瀉病人進行采樣調查，彎曲菌陽性率為0.89%。其中空腸彎曲菌為0.74%，結腸彎曲菌為0.15%，二者差異無統計學意義（P＝0.219）。按年齡組分別為0～歲組1.19%、1～歲組0.66%、2～歲組0.00%、5～歲組1.56%、10～歲組0.00%、20～歲組4.08%、30～歲組0.00%、40～歲組0.00%、50～歲組0.00%、60～歲組0.00%。其中，0～歲組、1～歲組和20～歲組檢出空腸彎曲菌，陽性率分別為1.19%、0.66%和4.08%；5～歲組檢出結腸彎曲菌，陽性率為1.56%；按季節分，除冬季外，其余季節均檢出陽性彎曲菌，檢出陽性率分別為春季（3～5月）為1.16%、夏季（6～8月）為1.23%、秋季（9～11月）為0.62%，不同季節彎曲菌陽性率差異無統計學意義（χ2＝1.600，P＝0.659）。其中空腸彎曲菌在春、夏、秋三個季節均有檢出，而結腸彎曲菌僅在春季檢出。

2.2 健康人群調查 對121名5歲以下兒童進行調查和采樣，結果表明總陽性率為8.26%，其中空腸彎曲菌和結腸彎曲菌陽性率分別為3.31%和4.96%，二者差異無統計學意義（P＝0.754）。其中，空腸彎曲菌以2歲以下檢出率為高，結腸彎曲菌則在每個年齡段均有檢出。不同年齡段彎曲菌檢出率差異無統計學意義（χ2＝2.282，P＝0.319），見表2。

表2 健康人群糞便標本檢出結果Tab.2 Detection result of Campylobacter in healthy population＇s stool samples

2.3 從業人員攜帶調查結果 本次調查共對養豬場和屠宰廠職工采集32份糞便標本，均未檢出空腸彎曲菌和結腸彎曲菌。

2.4 動物攜帶調查 對采集105份雞和50份豬糞便標本進行檢測，結果表明彎曲菌檢出陽性率為3.23%，其中空腸彎曲菌陽性率為1.29%，結腸彎曲菌陽性率1.94%，二者差異無統計學意義（P＝1.000）。雞和豬的彎曲菌檢出陽性率分別為2.86%和4.00%，二者差別無統計學意義（χ2＝0.142，P＝0.707），見表3。

表3 動物糞便標本檢出結果Tab.3 The detection result of Campylobacter in animal’s stool samples

2.5 PCR結果 見圖1。

圖1 彎曲菌陽性參考株和21份菌株標本PCR擴增電泳結果注：上圖泳道1、100bp Ladder Marker（最亮的條帶為500 bp）；泳道2－22為21株分離到的菌株；泳道23為空彎、結彎陽性對照；泳道24為陰性對照鼠傷寒沙門菌；泳道25為以水為模板的空白對照。Fig.1 PCR results of the positive reference strains of C.jejuni and 21 tested strainsLane 1：DNA Marker；Lane 2－22：tested strains；Lane 23：Positive control；Lane 24－25：Negative controls

2.6 菌株分型結果

2.6.1 PFGE圖譜 見圖2。

2.6.2 PFGE圖譜的聚類分析結果 對上述所得的PFGE圖譜，我們用Bio Numerics軟件進行了分析。結果表明4株空腸彎曲菌經Cluster分析后得到3個PFGE型?？漳c彎曲菌K018與K020的PFGE型完全相同，聚類相似性系數100%；空腸彎曲菌K021與中國CDC傳控所惠贈的空彎標株700819的PFGE型完全相同，空腸彎曲菌K018、K020與空彎K014的聚類相似性系數為82.35%，見圖3。

圖2 彎曲菌分離株的PFGE圖注：上圖中泳道1、5為標準菌株 H9812，泳道2、3、4為 K014、K018，K020；泳道 6、7 為 K021、空彎標株700819。Fig.2 PFGE result of tested strainsLane 1，5：H9812 Marker；Lane 2，3，4，6：C.jejuni K014，K018，K020，K021；Lane 7：Positive reference strains of C.jejuni

3 討 論

據美國國家食品網的監測，彎曲菌是發病率最高的病原菌，是全球范圍內胃腸炎的主要病因，其病例數已超過李斯特菌病、沙門菌病和志賀菌病，WHO已將彎曲菌腸炎列為最常見的腸道傳染病之一［4］。本研究已證實在廣西腹瀉病人中已成為重要的病原菌之一。本次彎曲菌檢出率偏低［5－6］，可能與基層醫務人員糞便的采樣質量、實驗室人員的檢測經驗和檢測條件有關，結果也可能在一定程度上受本研究樣本量的影響。

圖3 彎曲菌分離株PFGE圖譜的聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of tested strains

結果顯示，空腸彎曲菌在2歲以下的健康人群與腹瀉人群中檢出率均高，春夏秋季均有空彎檢出，以夏季為多，與文獻報道相符［5－7］。本研究顯示結彎在5歲以下的健康人群各年齡段與5～10歲組的腹瀉人群中有檢出，僅在春季檢出。

彎曲菌是多種動物如禽類、牛、羊及狗的正常寄居菌，可長期向外界排菌，從而引起人類感染［8］，因此，接觸和消費禽類等動物與流行有很大的關系。結果顯示，雞中空彎菌陽性率為1.29%，結彎菌陽性率為1.94%，在豬中沒有檢出空彎菌，僅檢出結彎菌，陽性率為4%。提示我區動物中攜帶彎曲菌比較普遍，且流行呈現多樣化。

近年來，PCR技術空腸彎曲菌檢測中廣泛應用［9］，本研究中，對外觀可疑的菌落，一是直接應用PCR技術進行檢測，二是應用常規的生化鑒定方法進行檢測，結果表明，PCR技術用時3 h，常規的鑒定需要2～3 d，PCR技術可以大大的縮短鑒定時間且特異性高。提示在以后的工作中，我們可以考慮直接對糞便標本應用PCR技術來進行檢測，這樣將會更加顯著的縮短檢測時間。對于空腸彎曲菌的分子分型，PFGE仍為公認的方法［10］。PFGE檢測的是整個細菌染色體上所有酶切位點的變化，從整體上反映不同菌株全部基因的相關性。本研究空腸彎曲菌K018（大新縣腹瀉病人糞便標本）與K020（南寧市腹瀉病人糞便標本）的PFGE型完全相同，提示二者可能存在相同的感染源。

由于彎曲菌對生長條件要求苛刻，檢測周期長，對人員的經驗、水平要求較高，因而基層實驗室通常不開展此項工作。廣西每年的腹瀉病例三十余萬例，腹瀉暴發疫情數十起，由于采樣和實驗條件以及檢測經驗等的原因，其中很可能有同源空腸彎曲菌引起事件被忽視。因此要加強對腹瀉病人及外環境、動物等相關樣品中空腸彎曲菌的流行病學監測。

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