低氧應激對人肝癌細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9表達的影響

吳之浩

（義烏市中心醫院 普外一科， 浙江 金華 322000）

低氧是實體瘤局部微環境的特征之一。低氧時，腫瘤細胞發生惡性生物學行為改變：糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉移能力增強，對化療藥物產生耐藥性，對放化療不敏感等[1]。前期研究發現，低氧應激促進人HepG-2細胞黏附、侵襲和遷移[2]。本研究模擬肝癌低氧微環境，探討低氧應激對人HepG-2細胞甲胎蛋白（AFP）、血管內皮生長因子（VEGF）、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1、基質金屬蛋白酶（MMP）-9表達的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株和主要試劑 人肝癌細胞株HepG-2引自蘭州軍區總醫院實驗科（來源于美國國立腫瘤研究所）， 胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產品，RT-PCR Kit 購于Takara公司，Trizol為Invitrogen公司產品。MMP-9、TIMP-1、VEGF ELISA試劑盒、AFP放射免疫試劑盒由上海生物制品研究所提供。

1.2 體外細胞培養及實驗分組 HepG-2細胞置滅活10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3～5天傳代一次。低氧組HepG-2細胞置37 ℃、5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養箱中培養24 h。

1.3 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達量的測定 Trizol一步法提取細胞總RNA，電泳見28 s、18 s條帶，以2.5μg總RNA為模板，以Takara公司的Random premier為引物進行逆轉錄反應合成cDNA。根據Genebank中人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin mRNA序列，用primer premier5.0計算機軟件設計引物（引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表1）。優化PCR反應條件，分別進行AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9與β-actin共擴增，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像儀攝片，用IamgeMaster Total v1.01軟件半定量分析各條帶面積，計算各目的基因與內參照β-ac-tin的光密度比值表示各目的基因的mRNA表達量。

表1 人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin引物設計

1.4 HepG-2細胞培養上清AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9含量的測定 取處于對數生長期的HepG-2細胞，按每孔1×105個細胞接種于24孔培養板，常氧、低氧組HepG-2細胞于常氧、低氧培養24 h；吸取細胞培養上清經1000 r/min離心15 min，取上清；放射免疫測定法測定AFP，酶聯免疫吸附法測定VEGF、TIMP-1、MMP-9含量，均嚴格按試劑盒說明操作。

1.5 統計學處理方法 應用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料用±s表示，兩樣本均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達 常氧、低氧組總RNA的28 s和18 s條帶比值為2:1，表明所提取的總RNA完整性好，可用于RT-PCR實驗。圖1和表2顯示：低氧組AFP、VEGF、MMP-9蛋白及mRNA的表達顯著高于常氧組，TIMP-1蛋白及mRNA的表達顯著低于常氧組（均P＜0.01）。

圖1 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達

表2 各組人HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達（n=8±s）

表2 各組人HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達（n=8±s）

與常氧組比：aP＜0.01

)常氧組 0.33±0.06144.68±7.30 0.42±0.0526.17±3.38 0.58±0.06 51.45±6.83 0.30±0.0466.24±4.20低氧組 0.57±0.05a187.93±5.60a0.59±0.06a52.70±4.03a0.29±0.04a30.44±7.12a 0.50±0.05a89.76±4.62a

2.2 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的相關性 VEGF mRNA與AFP、MMP-9 mRNA呈正相關（r=0.820、0.878，P＜0.01），與TIMP-1 mRNA呈負相關（r=-0.880，P＜0.01）；AFP mRNA與MMP-9 mRNA呈正相關（r=0.830，P＜0.01），與TIMP-1 mRNA呈負相關（r=-0.722，P＜0.01）；MMP-9 mRNA與TIMP-1 mRNA呈負相關（r=-0.835，P＜0.01）；VEGF蛋白與AFP、MMP-9蛋白呈正相關（r=0.923、0.876，P＜0.01），與TIMP-1蛋白負相關（r=-0.771，P＜0.01），AFP蛋白與MMP-9蛋白呈正相關（r=0.917，P＜0.01），與TIMP-1蛋白負相關（r=-0.848，P＜0.01），MMP-9蛋白與TIMP-1蛋白負相關（r=-0.863，P＜0.01）。

3 討論

低氧是實體瘤局部微環境的特征之一。低氧時低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α基因表達上調，轉位到細胞核內與HIF-1β形成異二聚體HIF-1。HIF-1與靶基因的啟動子或增強子上的低氧反應元件（hypoxia response element，HRE）5’-ACGTGC-3’結合，上調靶基因的表達并介導一系列腫瘤細胞對低氧的反應，腫瘤細胞發生惡性生物學行為改變：糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉移能力增強，對化療藥物產生耐藥性，對放化療不敏感等[1]。VEGF[3]、MMP-9[4]是HIF-1的靶基因，啟動子上存在HIF-1結合位點HRE。VEGF基因表達上調促進腫瘤血管新生[3]，同時也是一種免疫調節因子，能夠削弱樹突狀細胞功能而降低宿主的抗腫瘤免疫反應[3]。MMP-9（明膠酶B）屬于高度保守的Zn2+依賴的內切蛋白水解酶家族，可降解明膠和IV、V、VII、X型基底膜膠原和細胞外基質，TIMP-1能選擇性結合MMP-9活性中心的Zn2+，封閉其催化活性，從而特異性地抑制MMP-9的活性[5]。通常情況下，組織中MMP-9和TIMP-1之間保持著相對平衡狀態，它們的平衡和相互影響決定著細胞基質是降解還是聚集和腫瘤的侵襲和轉移的能力[6]。本實驗顯示：低氧應激上調HepG-2細胞VEGF基因的表達，與文獻[1]研究結果一致；上調MMP-9基因的表達，與文獻[4]研究結果一致；下調TIMP-1基因的表達。低氧應激上調HepG-2細胞MMP-9基因的表達、下調TIMP-1基因的表達，可能是低氧下肝癌細胞侵襲力增強的機制之一。

AFP基因屬于白蛋白基因家族，有三個增強子，是原發性肝細胞癌診斷的重要血清標記物，參與細胞增殖和代謝的調節，能促進肝癌細胞增殖[7]。本實驗顯示：低氧應激上調HepG-2細胞AFP基因的表達。賀濤等[8]研究提示：沉默AFP基因可抑制肝癌細胞的增殖活性。低氧應激上調HepG-2細胞AFP基因的表達可能是低氧下肝癌細胞增殖活性增強的機制之一。

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