二苯乙烯苷對人臍靜脈內皮細胞一氧化氮合酶及其基因的調節作用

沈建芬，張又枝，肖軍花，王嘉陵

(1.浙江省嘉興市第一醫院，314000;2.華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院藥理系，武漢430030)

二苯乙烯苷(2，3，5，4＇-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)是從何首烏中提取的活性成分，與人工合成的雌激素己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)及從法國紅葡萄酒中提取的白藜蘆醇(resveratrol，RES)具有相同的多羥基二苯乙烯結構。實驗證實，DES和RES均可通過上調內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的mRNA和蛋白的表達水平，增加一氧化氮(nitricoxide，NO)產量，產生舒張血管的作用[1-2]。筆者前期實驗發現，THSG具有舒張血管作用，且與增加血管NO產量有關[3-4]。因此推測

THSG增加NO產量產生舒張血管的作用可能與影響eNOS基因表達水平有關。筆者在本實驗中研究THSG對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)NO含量及eNOS活性的影響及其作用機制，以期從基因水平闡述THSG增加NO產量、舒張血管的作用機制，為THSG的開發利用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料THSG(華中科技大學同濟醫學院藥理系王嘉陵教授提供)，HUVECs(華中科技大學同濟醫學院細胞庫提供)，胰酶(購自Sigma公司，批號:9002077)，NO試劑盒(硝酸還原酶法)及NOS分型試劑盒購于南京建成生物工程有限公司。達爾伯克改良必需基本培養基(Dulbecco＇s modified minimal essential mediun，DMEM)及胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于Gibco公司。RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司。eNOS及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物合成為北京奧科公司。eNOS多克隆抗體及actin一抗購自Chemclo公司。

1.2 細胞培養及分組HUVECs用含10%FBS的DMEM培養液培養，3～4 d傳代1次，取處于對數生長期細胞進行實驗。實驗組加入1，10，100 μmol·L－1THSG(用DMEM配制，過濾除菌)，對照組不加其他試劑，均用含2%FBS的DMEM培養液在二氧化碳(CO2)培養箱培養。每個實驗組和對照組重復3次，取平均值。

1.3 HUVECs細胞上清液NO含量及eNOS活性的測定操作步驟嚴格按試劑盒操作說明書進行，721分光光度儀檢測吸光度(A)值。

1.4 RT-PCR檢測HUVECs eNOS mRNA表達水平總RNA抽提按照總RNA抽提試劑盒說明操作，A260/A280為1.8～2.0，取總RNA 1 μg，按照一步法RT-PCR試劑盒說明操作。eNOS引物序列正義:5＇-TCCTGTATGGCTCCGAGACC-3＇，反義:5＇-AGCAGGAGATGCTGTTGAAGC-3＇，擴增產物291 bp。GAPDH引物序列正義:5＇-GTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3＇，反義:5＇-CACGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3＇，擴增產物555 bp。RT-PCR條件:50℃30 min逆轉錄，94℃5 min預變性，然后94℃40 s變性，57℃40 s退火，72℃30 s延伸，共30個循環，最后72℃延伸7 min。RT-PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進行密度掃描，以eNOS/GAPDH灰度值計算待測基因相對表達量。

1.5 Western Blot檢測HUVECs eNOS蛋白表達HUVECs蛋白提取液經考馬斯亮藍法調整至相同濃度，以50 μg·L－1上樣，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維膜上。電轉后的硝酸纖維膜用含5%脫脂奶粉封閉液封閉，此后分別加入eNOS兔抗一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，TTBS漂洗，加入二抗(1∶1 000稀釋)孵育，再以PBST液振蕩洗滌(15 min×3次)，化學發光法顯色，凝膠定量軟件Quantity One 4.52分析，以actin作內參照。

1.6 統計學方法實驗數據用均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗統計處理，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THSG對HUVECs NO含量及eNOS活性的影響 各濃度THSG均使NO含量增加，使eNOS活性增強(P＜0.05或P＜0.01)，且隨著濃度增加，作用增強，具有濃度依賴性，見表1。

表1 4組HUVECs NO含量與eNOS活性測定結果Tab.1 Results of the content of NO and eNOS activity in 4 groups of HUVECs ±s

表1 4組HUVECs NO含量與eNOS活性測定結果Tab.1 Results of the content of NO and eNOS activity in 4 groups of HUVECs ±s

與對照組比較，*1P＜0.05，*2P＜0.01Compared with control group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

NO/eNOS/組別含量(μmol·g－1)活性(U·mL－1)

2.2 THSG對HUVECs eNOS mRNA表達的影響THSG可增強eNOS mRNA表達，且呈濃度依賴性。孵育24 h后，1 μmol·L－1THSG可使eNOS mRNA水平增加(P＜0.05);10 μmol·L－1THSG使eNOS mRNA水平顯著增加，平均吸光度為對照組的2.2倍(P＜0.01)，結果見圖1。

2.3 THSG對HUVECs eNOS蛋白表達的影響THSG可增強eNOS蛋白表達，且呈濃度依賴性。孵育48 h后，1 μmol·L－1THSG可使eNOS蛋白水平增加(P＜0.05)。10 μmol·L－1THSG使eNOS蛋白水平顯著增加，平均灰度值為對照組的2倍(P＜0.01)，結果見圖2。

3 討論

NO是一種半衰期很短的自由基分子，在許多生物反應和信號傳導途徑中發揮重要作用，信使作用最經典的例子是在血管壁，NO從上皮細胞彌散到血管壁平滑肌細胞，激活此處的鳥苷酸環化酶，引起血管平滑肌細胞松弛，血管舒張，還可以抑制血管平滑肌細胞增生和血小板聚集，影響血流等[5]。正常生理狀態下，內皮細胞可持續合成和釋放NO，調節血管張力。NOS是NO合成的限速酶，在體內，內源性NO是由NOS催化L-精氨酸(L-Arg)轉化而成，其合成與降解之間的平衡由L-Arg-NO通路的活性決定。哺乳動物體內存在內皮型(eNOS)、神經型(nNOS)與誘導型(iNOS)3種類型NOS[6]。eNOS主要分布在內皮組織，負責基礎NO的合成，內皮細胞產生NO的量受酶活性和(或)eNOS基因表達的調節[3]，激動劑誘導的鈣離子(Ca2+)依賴的eNOS活性快速而短暫的增強，可使內皮細胞迅速產生NO，NO含量于數分鐘內即達高峰[7]。在生理狀態下eNOS表達處于低水平，但可受多種因素調節，包括血流動力學、低氧、雌激素等[8]。

THSG與人工合成的雌激素己烯雌酚具有相似的結構，前期實驗發現其具有增強體外血管eNOS活性，增加血管NO含量，舒張血管等。有實驗報道[9]，THSG能提高動脈硬化大鼠NO含量及主動脈NOS表達。本實驗結果表明，THSG能增強HUVECs中NO含量和eNOS活性，上調eNOS mRNA和蛋白表達，并呈濃度依賴性。實驗中1，10，100 μmol·L－1THSG孵育24～48 h所引起的HUVEC mRNA和蛋白表達增多，提示THSG可通過上調血管內皮細胞中eNOS mRNA和蛋白表達，增加NO含量，從而產生舒張血管平滑肌作用。

總之，THSG可上調血管內皮細胞eNOS mRNA和蛋白表達，這可能是THSG增加NO量，舒張血管平滑肌的機制之一。

[1]KLEINERT H，WALLERATH T，EUCHENHOFER C，et al.Estrogens increase transcription of the human endothelial NO synthase gene:analysis of the transcription factors involved[J].Hypertension，1998，31(2):582－588.

[2]WALLERATH T，DECKERT G，TERNES T，et al.Resveratrol，a polyphenolic phytoalexin present in red wine，enhances expression and activity of endothelial nitric oxide synthase[J].Circulation，2002，106(13):1652－1658.

[3]劉其禮，班栩，張俊紅，等.二苯乙烯苷對大鼠主動脈舒張作用及其一氧化氮含量的影響[J].中國藥理學與毒理學雜志，2004，18(4):289－293.

[4]胡存華，趙立波，王曉敏，等.二苯乙烯苷增強正常血管內皮細胞抗氧化作用研究[J].醫藥導報，2007，26(2):138－139.

[5]HIROOKA Y，KISHI T，SAKAI K，et al.Effect of overproduction of nitric oxide in the brain stem on the cardiovascular response in conscious rats[J].J Cardiovasc Pharmacol，2003，41(Suppl 1):119－126.

[6]丁媛媛，邱搖麟，王四旺，等.桂皮醛治療CVB3誘發的小鼠病毒性心肌炎研究[J].醫藥導報，2009，28(8):970－974.

[7]FLEMING I，FISSLTHALER B，DIMMELER S，et al.Phosphorylation of Thr(495)regulates Ca2+/Calmodulindependent endothelial nitric oxide synthase activity[J].Circ Res，2001，88(11):E68－E75.

[8]LI H，WALLERATH T，FORSTERMANN U.Physiological mechanisms regulating the expression of endothelial type-NO sythase[J].Nitric Oxide，2002，7(2):132－140.

[9]張偉，李鋒，王玉琴，等.二苯乙烯苷預防性干預大鼠動脈硬化對其一氧化氮合酶表達的影響[J].中國藥理學通報，2007，23(9):1213－1218.