固相萃取離子色譜法測定反義寡核苷酸藥物雜質(zhì)*

馬金平，仲婕，魯?shù)さぃ瑥埥痃姡┟髦椋邒龋斓骂I(lǐng)

(1.杭州天龍藥業(yè)有限公司，310021;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850)

反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides)是一種新型抗腫瘤和抗病毒的靶向治療藥物，由固相合成而得成品。由于在合成和工藝中使用了醋酸(acetic acid，MCAA)、二氯乙酸(dichloroacetic acid，DCAA)等溶劑，純化工藝中使用了氯化鈉，因此有必要建立寡核苷酸原料藥中雜質(zhì)MCAA、DCAA和氯離子(Cl－)的質(zhì)控方法。目前通用的有機(jī)殘留測定方法來自于ICH和《中華人民共和國藥典》2010年版氣相色譜法(GC)[1]，由于MCAA極性大，沸點(diǎn)較高，需要對樣品進(jìn)行衍生化處理，定量結(jié)果變異較大，《中華人民共和國藥典》2010年版又收載了MCAA殘留的液相色譜方法[1]，筆者經(jīng)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)峰形不好、檢測限高，長期用于生產(chǎn)化藥物控制對色譜柱有一定損耗;對含鹵素的殘留溶劑DCAA，GC-FID法靈敏度低，GC-ECD則會受氧元素影響。MCAA和DCAA都是能夠離子化的化合物，可在水中離解，離子色譜(IC)是較好的選擇，早期國內(nèi)有文獻(xiàn)報道用梯度淋洗IC法分析DCAA和MCAA[2-3]，筆者采用IC等度分析，同時測定寡核苷酸原料藥中的雜質(zhì)MCAA、DCAA和Cl－的含量，方法簡單，快捷可靠，線性范圍寬，所需試劑少，檢測靈敏度高，可為建立ASON質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器美國Dionex公司ICS-900型離子色譜儀，抑制型電導(dǎo)檢測器，Chromeleon色譜工作站。分析柱:Ionpac AS23(4 mm×250 mm)，保護(hù)柱:Ionpac AG23(4 mm×50 mm)。美國Agilent 6890N氣相色譜儀，色譜柱:HP-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。C18固相萃取小柱:WAT020805，Waters Sep-pak C183cc/500 mg。

1.2 試藥碳酸氫鈉(NaHCO3，F(xiàn)luka分司生產(chǎn)，批號:0001446842，色譜純)，無水碳酸鈉(Na2CO3，天津市化學(xué)試劑研究所生產(chǎn)，優(yōu)級純，含量≥99%)，二氯乙酸(Sigma-Alorich公司生產(chǎn)，批號:STBB5017，純度≥99%)，氯離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg·L－1，購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)，甲醇(MERCK生產(chǎn)，含量≥99.9%，色譜純)，冰醋酸和濃硫酸均為分析純，實(shí)驗(yàn)中所用的水由Millipore公司Simplieity生產(chǎn)，電阻率＞18.2 MΩ·cm－1的去離子超純水。寡核苷酸樣品由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所九室提供(FLU批號:20100415，20100420，20100512;CT102批號:20110113-1，20110113-2，20110113-3)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件陰離子色譜分析柱Ionpac AS23(4 mm×250 mm);陰離子色譜保護(hù)柱Ionpac AG23(4 mm×50 mm);流動相:0.8 mmol·L－1NaHCO3/4.5 mmol·L－1Na2CO3;電導(dǎo)檢測;流速1 mL·min－1;抑制器的抑制電流為25 mA;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品儲備液的制備

2.2.1 MCAA對照品儲備液的配制精密量取MCAA適量，用水定量稀釋制成每毫升含MCAA 0.4 μg的溶液，置4℃冰箱備用。

2.2.2 DCAA對照品儲備液的配制精密量取DCAA適量，用水定量稀釋制成每毫升含DCAA 0.156 μg的溶液，置4℃冰箱備用。

2.2.3 Cl－標(biāo)準(zhǔn)溶液1 000 mg·L－1，購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

2.3 樣品溶液的制備精密稱取樣品100 mg，置10 mL量瓶，用水稀釋至刻度，用C18固相萃取小柱過濾，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)取一定濃度的對照品溶液、樣品溶液、加對照品的樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，記錄圖譜。結(jié)果樣品中可能含有的化合物均可實(shí)現(xiàn)分離，且分離良好。MCAA與Cl－分離度10.26;DCAA與Cl－分離度4.56;理論板數(shù):MCAA 6 173，DCAA 8 143，Cl－9 659;不對稱因子:MCAA 1.39，DCAA1.10，Cl－1.15;精密度:MCAA RSD為3.47%，DCAA RSD為0.8343%，Cl－RSD為1.54%。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.5.1 MCAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取MCAA對照品儲備液適量，用水分別稀釋成0.002，0.004，0.04，0.2，0.4 μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計算回歸方程，MCAA:Y=5.230 7X+0.014(r=0.999 7)。結(jié)果MCAA在0.002～0.400 μg·mL－1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 DCAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取DCAA對照品儲備液適量，用水分別稀釋成0.000 624，0.003 12，0.006 24，0.031 2，0.156 μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計算回歸方程，DCAA:Y=19.762X－0.007 2(r=0.999 9)。結(jié)果表明DCAA在0.000 624～0.156 μg·mL－1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.3 Cl－標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取Cl－標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水分別稀釋成0.002 4，0.024，0.06，0.3，1.5 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計算回歸方程，Cl－:Y=507.4X－0.746 2(r=0.999 8)。結(jié)果表明Cl－在2.4×10－3～1.5 mg·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)取一定濃度的MCAA、DCAA、Cl－對照品溶液，每次進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得峰面積，MCAA RSD為3.47%(n=6)，DCAA RSD為0.83%(n=6)，Cl－RSD為1.54%(n=6)。

2.7 靈敏度實(shí)驗(yàn)

2.7.1 檢測限的測定將MCAA對照品溶液逐步稀釋，測得MCAA的檢測限為0.02 ng·mL－1(S/N=3);將DCAA對照品溶液逐步稀釋，測得DCAA的檢測限為0.312 ng·mL－1(S/N=3);將Cl－對照品溶液逐步稀釋，測得Cl－的檢測限為0.01 μg·mL－1(S/N=3)。

2.7.2 定量限的測定將MCAA對照品溶液逐步稀釋，測得MCAA的定量限為1 ng·mL－1(S/N=10);將DCAA對照品溶液逐步稀釋，測得DCAA的定量限為0.78 ng·m L－1(S/N=10);將Cl－對照品溶液逐步稀釋，測得Cl－的定量限為0.04 mg·mL－1(S/N=10)。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取MCAA、DCAA、Cl－對照品溶液各1份，于室溫0，2，4，6，8，10 h后分別進(jìn)樣10 μL，測得峰面積，MCAA的RSD為1.53%，DCAA的RSD為1.88%，Cl－的RSD為1.07%。可見對照品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 IC法與GC法測定MCAA與DCAA的比較研究GC方法:毛細(xì)管柱頂空進(jìn)樣系統(tǒng)程序升溫法。儀器:美國Agilent 6890N氣相色譜儀，色譜柱:HP-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。色譜條件:柱溫采用程序升溫:初溫35℃，維持2 min，以20℃·min-1的速率升溫至135℃，再以30℃·min-1的速率升溫至285℃，維持3 min;進(jìn)樣口溫度為280℃;檢測器溫度為270℃;載氣為氫氣，采用分流進(jìn)樣模式，分流比8∶1，柱流速1.2 mL·min－1。頂空瓶平衡溫度為80℃，平衡時間為120 min。頂空進(jìn)樣40 μL，記錄色譜圖。對照品溶液:精密量取MCAA 119 μL和DCAA 80 μL，置25 mL量瓶，用甲醇溶解稀釋至刻度，精密量取1 mL置10 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液。

樣品衍生:取本品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成為100 mg·mL－1的樣品溶液，取此溶液1.0 mL，置頂空瓶中，加入對照品溶液1.0 mL，加入濃硫酸0.5 mL，封蓋，置于85℃下反應(yīng)8 h以上。進(jìn)樣:在最佳的頂空條件下(80℃，120 min)使達(dá)到氣液平衡，手動移取頂空蒸氣40 μL進(jìn)樣，結(jié)果見表1。

通過表1可以看出IC法較GC法精密度好，定量限、最小檢測限低，線性范圍寬。

2.10 樣品測定

2.10.1 樣品定量測定取樣品3批，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，記錄色譜圖。

2.10.2 樣品限度檢查精密量取MCAA 7.5 μL置50 mL量瓶，用水稀釋至刻度，作為MCAA對照品溶液;精密量取DCAA 4.8 μL置50 mL量瓶，用水稀釋至刻度，作為DCAA對照品溶液;精密量取Cl－標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5 mL置50 mL量瓶，用水稀釋至刻度，作為Cl－對照品溶液。精密量取上述3種溶液各5 mL，搖勻，進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定。

3 討論

樣品中可能含有MCAA、DCAA和Cl－雜質(zhì)，筆者所選擇的色譜系統(tǒng)中，Cl－位于兩個殘留溶劑MCAA與DCAA之間，3個峰共存情況下，分離度能達(dá)到《中華人民共和國藥典》2010年版要求，實(shí)現(xiàn)完全分離，且可分別定量。

采用該IC法測定寡核苷酸原料藥中雜質(zhì)MCAA、DCAA、Cl－的含量，方法學(xué)的線性范圍寬、精密度、靈敏度結(jié)果都較滿意，既能滿足殘留限度檢查的需要，又能在一定范圍內(nèi)作定量分析。

該方法一次進(jìn)樣即可準(zhǔn)確定量樣品中MCAA(tR=4.757 min)、Cl－(tR=7.540 min)和DCAA(tR=8.977 min)的含量，對于硫代修飾的寡核苷酸(可能有磷酸鹽和硫酸鹽)，還可以同時測定PO3－4(tR=19.130 min)和SO2－4(tR=21.427 min)的含量，所需試劑少，方法簡單、快捷，為固相合成多肽和固相合成寡核苷酸藥品雜質(zhì)控制提供了可靠易行的方法。

根據(jù)殘留溶劑的限度規(guī)定[1]:MCAA 0.5%，DCAA 0.5%，寡核苷酸原料藥企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定Cl－含量應(yīng)不高于0.1%，按限度配制對照品溶液和供試品溶液，各組分峰面積小于限度規(guī)定的對照品峰面積，且FLU樣品中MCAA、DCAA、Cl－平均含量分別為0%，0%，0.000 048%，CT102樣品中MCAA、DCAA、Cl－平均含量分別為0%，0%，0.000 08%，說明樣品雜質(zhì)在《中華人民共和國藥典》和2010年版企業(yè)內(nèi)控規(guī)定的限度范圍內(nèi)。

表1 IC法和GC法測定MCAA與DCAA比較Tab.1The comparative study of IC and GC for determination of MCAA and DCAA

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄55，61－65.

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