柱前衍生化法測定晶帽石斛中總氨基酸含量*

李光，李學蘭，陳曦，2

(1.中國醫學科學院、北京協和醫學院藥用植物研究所云南分所，云南景洪666100;2.中國醫學科學院、北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193)

石斛為名貴中藥材，在我國有悠久的藥用歷史，被《神農本草經》列為上品，認為該藥“味甘、平。主傷中，除痹，下氣，補五臟虛勞羸瘦，強陰。久服厚腸胃，輕身延年。”目前廣泛用于保健品、藥品及石斛湯、石斛酒等飲品。目前市場流通石斛樣品多為鐵皮石斛、齒瓣石斛、晶帽石斛、金釵石斛等及其楓斗類，臨床也多將這幾種石斛混合應用。其中晶帽石斛(Dendrobium crystallinumTchb.F.)種植技術要求低，產量較高，具有較高的經濟價值。筆者在本實驗中針對晶帽石斛中營養成分氨基酸類進行測定，以期完善晶帽石斛基礎研究，為后期藥效學研究提供理論依據。

目前已經報道的用于氨基酸柱前衍生的衍生試劑很多，主要有2，4-二硝基氟苯(DNFB，2，4-Dinitrofluoro benzene)[1]、鄰苯二甲醛(OPA，O-Phthalic aldehyde)[2]、氯甲酸芴甲酯(VMOC-Cl，9-fluorenylmethyl chloroformate)[3]、異硫氰酸苯酯(PITC，phenyl isothiocyanate)[4]、丹磺酰氯(Dansyl-C1，Dansylchloride)[5]及6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC，6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimicly carbamate)[6]等。不同的衍生劑都有各自的不足，其中DNFB作為衍生劑具有成本低、衍生產物穩定、操作簡便等優點，被廣泛應用。筆者利用DNFB柱前衍生化方法針對晶帽石斛中總氨基酸類成分進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 實驗藥材晶帽石斛藥材購自晶帽石斛種植戶，樣品信息見表1。

表1 晶帽石斛樣品信息表Tab.1The sample informations ofDendrobium crystallinum Tchb.F.

1.2 實驗試劑醋酸鈉(成都格雷西亞化學技術有限公司，分析純，批號:20100322)，醋酸(天津市光復精細化工研究所，分析純，批號:20081112)，N，N-二甲基甲酰胺(成都格雷西亞化學技術有限公司，分析純，批號:20100317)，DNFB(成都格雷西亞化學技術有限公司，分析純，批號:201006211)，碳酸鈉(成都格雷西亞化學技術有限公司，分析純，批號:201005161)，乙腈(天津市風船化學試劑科技有限公司，分析純，批號:071001)，乙腈(美國Fisher公司，色譜純，批號:L071012911)，磷酸二氫鉀(成都格雷西亞化學技術有限公司，分析純，批號:201004Z71)，氫氧化鈉(成都格雷西亞化學技術有限公司，分析純，批號:21004771)，苯酚(天津市大茂化學試劑廠，分析純，批號:100516)，十八種氨基酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:140624-200805)。

1.3 儀器Waters 600高效液相色譜儀，配Waters 2489紫外檢測器，Empower色譜工作站(美國沃特世公司);TGL16M湘智離心機(安徽誠信啟動設備有限公司);數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);電子天平(賽多利斯公司);分析天平(賽多利斯公司);酒精噴燈(上饒市教學儀器廠)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Waters 600高效液相色譜儀配Waters 2489紫外檢測器，Empower色譜工作站(美國沃特世公司)。色譜柱:菲羅門公司Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相(A):0.05 mol·L－1醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH=6.4)，加入1%N，N-二甲基甲酰胺。流動相(B):乙腈∶水(1∶1)，洗脫程序如表2。檢測波長:360 nm，流速:1 mL·min－1，柱溫:30℃。

表2 梯度洗脫程序表Tab.2Gradient elution program

2.2 標準溶液的配制分別精密稱取氨基酸對照品適量，置50 mL容量瓶，加水至刻度搖勻，精密量取1.0 mL置10 mL量瓶，依次加入0.5 mol·L－1碳酸鈉(pH為9.0)溶液和1%DNFB乙腈溶液各1.0 mL，搖勻后在50℃水浴中避光加熱90 min，取出后加入磷酸鹽緩沖液(稱取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液29.1 mL，加水定容至100 mL，測得pH為7.0)至刻度，作為對照品溶液。

2.3 樣品水解及衍生化精密稱取過內徑297 mm(50目)篩樣品0.500 0 g，置20 mL安瓿，加入含3%苯酚的6 mol·L－1鹽酸溶液10 mL，酒精噴燈封口，于105℃加熱22 h，取出放至室溫，過濾，蒸干，定容至10 mL。取定容液1 mL，依次加入0.5 mol·L－1碳酸鈉(pH9.0)溶液和1%DNFB乙腈溶液各2.0 mL，酒精噴燈封口，50℃避光加熱90 min，得到溶液用孔徑為0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣。

2.4 精密度實驗精密量取水解定容后樣品溶液1.0 mL，按“2.3”項制備供試品溶液。連續進樣6次，分別測定樣品中各氨基酸峰面積的RSD。結果表明RSD在0.231%～2.246%。說明儀器精密度良好，此儀器測得的數據可靠。

2.5 重復性實驗重復5次精密量取水解定容后樣品溶液1.0 mL，按“2.3”項制備供試品溶液。測定樣品中各氨基酸峰面積的RSD。結果表明RSD在0.128%～2.073%，RSD＜3%，說明實驗重復性結果良好。

2.6 線性關系考察分別精密稱取處方量氨基酸對照品適量，置100 mL量瓶，加水至刻度，搖勻，分別精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置10 mL安瓿，按“2.3”項制備供試品溶液。分別精密吸取2 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以樣品濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得線性方程，結果見表3。

表3 氨基酸線性實驗結果Tab.3Linear test of amino acids

結果表明，各氨基酸進樣濃度在上述范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.7 溶液穩定性實驗精密量取水解定容后樣品溶液1.0 mL，按“2.3”項制備供試品溶液。分別在0，2，4，6，8 h進樣，共測定5次，結果氨基酸基本穩定。建議樣品溶液制備完后8 h內完成。

2.8 回收率實驗按預實驗中測定的各氨基酸含量，精密稱取各氨基酸對照品適量，與樣品混合，按“2.3”項制備供試品溶液，取20 μL注入高效液相色譜儀，測定，計算各氨基酸回收率。結果表明各氨基酸含量平均值在99.34%～101.93%，RSD在0.54%～1.91%，說明各氨基酸的回收率數據符合要求。

2.9 樣品測定取晶帽石斛樣品約0.5 g，按照“2.3”項制備進樣，所得結果如圖1～4及表4所示。

圖2 S1-S10晶帽石斛樣品色譜圖Fig.2Dendrobium crystallinum Tchb.F.samples

3 討論

采用DNFB與氨基酸的柱前測定晶帽石斛藥材中各氨基酸的含量，衍生反應條件易于控制，反應簡單，分析結果的精密度、線性相關性、重復性均較好，回收率高。

圖3 晶帽石斛樣品中總氨基酸含量Fig.3Total content of amino acids in Dendrobium crystallinum Tchb.F.samples

表4 晶帽石斛樣品中氨基酸保留時間及含量Tab.4Retention time and content of amino acids in Dendrobium crystallinum Tchb.F.samples

筆者在本實驗中分別針對水解條件及衍生化條件進行了考察，發現衍生化的溫度與時間對結果影響較大，建議衍生化溫度為50℃，時間為90 min。衍生化試劑量增加，峰面積沒有明顯改善。水解溫度對結果影響較大，可能是因為隨著水解時間的延長，會破壞氨基酸的結構或導致各類氨基酸之間相互轉化而影響結果。

現代營養學表明[7]，谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等在人體氮平衡中發揮重要作用，晶帽石斛中這幾種氨基酸含量較高，并且所含氨基酸種類符合世界糧農組織/世界衛生組織/聯合國大學[8]提出的成人氨基酸需求量模式，也為確定晶帽石斛的營養價值提供了理論依據。

(志謝:感謝王云強老師在樣品采集過程中給予的大力支持!)

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