牛奶和嬰兒配方奶粉中三聚氰胺篩選和定量方法—— ELISA，HPLC-UV，GC-MS和LC-MS/MS的驗證和測定效果（三）

文 / 季昀 龐學燕 譯

（江蘇揚州大學動物科學與技術學院）

▲接本刊2012年第8期

圖1 MBPIF的UV色譜圖（240 nm，奶粉蛋白質含量> 15%）

3.1.2 HPLC-UV法工作特性

學者們提出了幾種用HPLC-UV定量測定三聚氰胺的方法（Ishiwata，Inoue，Yamazaki，et al，1987；Kim，et al，2008；Mu?iz Valencia，et al.，2008）。首先，使用三氯乙酸（TCA）－乙腈溶液沉淀蛋白質，接著用強離子交換（SCX-SPE）柱進行清洗，然后，洗脫液用C18 RP柱，通過離子對HPLC進行分離。所選的色譜條件可使三聚氰胺從包含有CM和MBPIF的有機成分中分離出來（圖1）。除了用保留時間確定外，在200 nm到400 nm之間記錄三聚氰胺光譜特性也可用來確定所選峰的特性。

三聚氰胺紫外光譜的吸收譜帶大約在240 nm處（圖2），這些吸收譜帶是三聚氰胺的標志。但是，如果色譜層析進行的條件和樣本處理得不夠小心，干擾物質可能會使三聚氰胺的定量出現錯誤。尤其是像嬰兒配方奶粉這樣含有復雜蛋白質水解形式的低敏感度樣本用這種方法會受到干擾，因為通過沉淀法或固相萃取沒有將肽徹底去除，所以會導致三聚氰胺含量的明顯高估。因此，波長范圍至少在200～270 nm的紫外光譜的記錄結果需要與三聚氰胺標準品的光譜記錄結果進行比對。另外，樣本中蛋白質的含量對沉淀效果影響很大，研究發現，被測樣本的量的多少必須根據它的蛋白質含量進行調整。為了確保有效的沉淀和好的分離效果，待測樣本最佳蛋白含量應在0.3～0.4 g。

對于CM，HPLC-UV方法可以檢測三聚氰胺從0.05 mg/kg到2.50 mg/kg的動態線性變化，對于蛋白質質量分數小于15%的MBPIF，檢測范圍在0.13 mg/kg到6.25 mg/kg之間，而對于蛋白質質量分數≥15%的MBPIF，檢測范圍在0.25 mg/kg到12.50 mg/kg。CM以0.03 mg/kg（0.09 mg/kg）測定LOD 和LOQ，而蛋白質含量小于15%的MBPIF為0.06 mg/kg（0.18 mg/kg），蛋白質含量≥15%的MBPIF為0.12 mg/kg（0.36mg/kg），LOD和LOQ信噪比分別為3和10。本試驗對含3 個不同濃度水平的三聚氰胺的CM和MBPIF測定了重復率和批間精密度和回收率，這些工作特性總結于表4（見2012年第8期）。

作為半定量測定CM和MBPIF中三聚氰胺殘留的可靠方法，ELISA和HPLC-UV法都能夠滿足指定的范圍要求（世界衛生組織和不同國家最常見的對于嬰兒配方食品中的三聚氰胺限制量為1 mg/kg，對于其它牛奶和以牛奶為原料的食品或其它食品為2.5 mg/kg）。就樣本的快速篩選來講，分析時間和相對簡單的儀器設備及數據處理是理想的，但是，對于三嗪殺蟲劑環丙氨嗪等ELISA具有特異性交叉反應性的樣本來說，這些分析技術是受限制的。UV和二極管陣列檢測（DAD）對于HPLC分離的樣本具有更低的選擇度，因為很多有機物的吸收波長在200～270 nm之間（Ehling，Tefera& Ho，2007； Patakioutas，et al，2007），因此，推薦二者用于篩選。

圖2 用DISCOVERY C18柱于240 nm下分離的三聚氰胺標準品溶液（0.4 μg/mL）

圖3 1.5 ng/mL三聚氰胺標準溶液（上）和，-三聚氰胺標準溶液（下）GC-MS全掃描色譜圖

3.2 鑒定方法

GC-MS對被測物的分離效果較好，因為其是根據分子量選擇靶分子，并鑒定其特征的。使用穩定的同位素標記三聚氰胺內標和單離子監測模式定量測定實現了精確定量。在評價方法中，串聯質譜法（MS/MS）提供了高度的分離性，它根據靶分子的分子量選擇靶分子，通過使用多重反應監測已知的碎片離子量來鑒定特性。應用穩定同位素標記內標的同位素稀釋法表明該方法對不同樣本基質效應可以進行補償（Smoker，Krynitsky，2008）。前人研究證實了，在寵物食品（Dobson，et al，2008；Varelis，Jeskelis，2008）和CM以及MBPIF中（Desmarchelier，et al，2009）能夠運用穩定同位素稀釋LC-MS/MS 技術定量測定三聚氰胺和三聚氰酸。

圖4 添加0.025 mg/kg 三聚氰胺的MBPIF樣本萃取SIM色譜圖

3.3 GC-MS法工作特性

按照之前描述的分析程序，包括用乙腈沉淀蛋白質，然后用強離子交換固相萃取（SCX-SPE）清洗，再衍生。進一步通過GC-MS分析三甲基硅烷基衍生物，在選擇性離子監測模式（SIM）下進行定量，如果需要進一步鑒定標準，則需要在全掃描（FS）模式下進行。選擇用于定量和鑒定的離子見表1（見2012年第4期）。圖3顯示了三聚氰胺標準溶液及其內標的全掃描色譜圖和質譜。3個三聚氰胺碎片和2 個標記的標準品碎片的單離子檢測色譜圖見圖4。這種方法使三聚氰胺能夠明確地被鑒定出來。由于同位素稀釋法的可靠性，校正和測試樣本只需相同的內標物溶液即可。這種方法只受到未標記三聚氰胺標準品的不準確前處理和被測部分權重的精密度不足的影響。

圖3顯示了已萃取的2 種主要的離子和標記三聚氰胺的差減質譜。3種主要的離子的萃取用于三聚氰胺，2種用于標記的三聚氰胺。圖4分別為差減質譜圖。

三聚氰胺離子質荷比為m/z 171、327和342，而被標記的三聚氰胺產生的質荷比為m/z 333和m/z 348。以批間精密度（iR）為基礎獲得的6 個不同的外標曲線來測試線性度。MBPIF中線性度超過了三聚氰胺的0～0.500 mg/kg 的范圍。校正曲線為線性模型，殘留物均勻分布，且響應系數穩定在考慮的濃度范圍內。根據批間精密度來驗證數據，按照所描述的GC-MS法測定的LOD （0.025、0.050和0.075 mg/kg 每個6 個重復），根據2002/657/EC 采用的5%的β型錯誤于0.019 mg/kg 進行鑒定的批間精密度來驗證數據（0.025、0.050和0.075 mg/kg每個6 個重復），根據2002/657/EC 采用的1%的α型錯誤并于0.009 mg/kg 來鑒定進行計算。對MBPIF中4 個不同濃度水平的三聚氰胺測定了重復性和批間精密度范圍和回收率。這些工作特性總結于表4（見2012年第8期）。

（未完待續）