兔病毒性出血癥病毒“LQ”株的分離鑒定

劉 勇，方鵬飛，歐陽宇藝

（四川省華派生物制藥有限公司，四川 簡(jiǎn)陽 641400）

兔病毒性出血癥俗稱兔瘟，是由兔病毒性出血癥病毒（RHDV）所致的一種兔急性、敗血性、高度接觸性、致死性和以全身實(shí)質(zhì)器官出血為主要特征的傳染病，尤以長(zhǎng)毛兔最為易感，主要侵害2月齡以上的青壯年兔。本病于1984年初首先在我國(guó)江蘇等地暴發(fā)，隨即蔓延到全國(guó)多數(shù)地區(qū)。RHDV屬杯狀病毒科，病毒粒子呈球形，直徑32～36 nm，為十二面體對(duì)稱，無囊膜。RHDV與其他杯狀病毒相比血凝特性顯著，能凝集人類的各型紅細(xì)胞。本試驗(yàn)對(duì)成都龍泉某兔場(chǎng)疑似出血癥發(fā)病死亡的兔的病料進(jìn)行病原分離鑒定，以確診是否為兔病毒悸出血癥感染。

1 材料與方法

1.1 試劑 改良馬丁瓊脂、麥康凱瓊脂、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基，由青島海博生物技術(shù)有限公司提供；甲醛，由成都市科龍化工試劑廠提供；人“O”型紅細(xì)胞，由本公司“O”型血同事提供。

1.2 毒種 兔病毒性出血癥病毒北京株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 RHDV抗血清 由本公司質(zhì)量管理部自制。

1.4 試驗(yàn)兔 日本大耳白兔，體重2.0kg，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.5 細(xì)菌學(xué)檢查 對(duì)無菌采集的病料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)，接種含4%血清及0.1%裂解全血的改良馬丁瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿、厭氣肉肝湯，37℃下培養(yǎng)5日，觀察記錄結(jié)果。

1.6 RHDV LQ株的血凝性試驗(yàn) 采用微量法。先將病料肝臟1份加9份生理鹽水研磨，離心取上清備用；再取25μL上清在96孔板上作倍比稀釋，每孔加入25μL 1%人“O”型紅細(xì)胞懸液；并設(shè)立紅細(xì)胞對(duì)照孔，以紅細(xì)胞100%凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

1.7 RHDV LQ株的特異性試驗(yàn) 采用微量法。先配制4個(gè)血凝單位（即4HA）血凝素，在96孔板上每孔加25μL 4HA血凝素，然后加RHDV抗血清25μL，37℃感作30min后，加入25μL 1%人“O”型紅細(xì)胞懸液，室溫靜置15～30min觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)立生理鹽水對(duì)照、RHDV抗血清對(duì)照、4HA對(duì)照。當(dāng)生理鹽水對(duì)照組、RHDV抗血清對(duì)照組、4HA血凝素與RHDV抗血清中和組均不凝集，而4HA對(duì)照組呈100%的紅細(xì)胞凝集時(shí)，判定RHDV LQ株為兔出血性病毒特異性陽性。

1.8 RHDV LQ株的毒力鑒定

1.8.1 RHDV LQ株致病性鑒定 用生理鹽水將RHDV LQ株病料作10倍稀釋，頸部皮下接種4只健康易感試驗(yàn)兔，每只1.0mL,觀察96h并記錄接種兔的發(fā)病時(shí)間、臨床癥狀、病理剖解變化。采集死亡接種兔的肝臟病料，重復(fù)以上試驗(yàn)，連續(xù)4次，詳細(xì)記錄，并同時(shí)進(jìn)行血凝效價(jià)測(cè)定、特異性試驗(yàn)。

1.8.2 RHDV LQ株對(duì)家兔半數(shù)致死量的測(cè)定 取第5代RHDV LQ株肝組織，用生理鹽水作10倍系列稀釋，取 10-5、10-6、10-7、10-84 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別頸部皮下注射6只健康易感兔，1mL/只，觀察7d，并詳細(xì)記錄。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌學(xué)檢查試驗(yàn) 37℃培養(yǎng)5日后，發(fā)現(xiàn)含4%血清及0.1%裂解全血的改良馬丁瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿、厭氣肉肝湯中均無細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.2 RHDV LQ株的血凝性試驗(yàn) 結(jié)果見表1。由表1可知:RHDV LQ 株可凝集人“O”型紅細(xì)胞，HA為 10×26。

表1 RHDV LQ株的血凝性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 RHDV LQ株的特異性試驗(yàn)結(jié)果 見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明:RHDV LQ株的血凝特性可被RHDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和，證明RHDV LQ株具有特異性。

表2 RHDV LQ株的血凝性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 RHDV LQ株的毒力鑒定試驗(yàn)結(jié)果 見表3、表4。試驗(yàn)結(jié)果表明:RHDV LQ株連續(xù)傳代4次均對(duì)家兔具有高致病性，證明RHDV LQ株為強(qiáng)毒株。根據(jù)表4數(shù)據(jù)按Reed-Muench法計(jì)算RHDV LQ株對(duì)家兔的LD50為 10-6.87/mL。

表3 RHDV LQ株傳代試驗(yàn)結(jié)果

表4 RHDV LQ株對(duì)家兔的LD50測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 通過細(xì)菌學(xué)檢查、血凝性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)，確定此次從龍泉某兔場(chǎng)所分離的病原為兔出血性病毒。對(duì)RHDV LQ株的鑒定結(jié)果表明:此毒株是具有血凝特性、高致病力的RHDV強(qiáng)毒株。

3.2 兔病毒性出血癥是影響?zhàn)B兔業(yè)的重要疾病。本公司正在對(duì)RHDV LQ株進(jìn)行更深入地研究和試驗(yàn)，力爭(zhēng)研制出安全、高效、經(jīng)濟(jì)的疫苗應(yīng)用于兔業(yè)生產(chǎn)中。

[1]殷震，劉振華.杯狀病毒科[A].動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社，1997:525-530.

[2]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典2010版三部[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.