同時培養(yǎng)法與吸附法微生物固定化對比

山 丹，馬 放，張 斯，王 晨，3

(1.哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.中日友好環(huán)境保護中心，100029北京;3.中國國際工程咨詢公司，100044北京)

微生物固定化技術是指將微生物通過一定的技術手段(如利用載體材料、包埋物質或合理控制水力條件等)保持在反應器內.菌絲球是由霉菌的自絮凝現(xiàn)象產(chǎn)生的具有一定機械強度和大小的球體，它除了具有生物活性良好、沉降速度快、易于固液分離等優(yōu)點外，吸附和降解效能近來也被廣泛關注［1-4］.目前，國外主要注重對菌絲球基礎理論和結構方面的研究，國內的研究則大多是面向應用的［5-7］.菌絲球在工業(yè)廢水處理方面的研究起步比較晚，目前還沒有實際應用的例子，實驗室研究也只涉及到對重金屬廢水和印染廢水的吸附［8-13］.應用菌絲球作為載體是最新的研究方向，文獻［14］以曲霉形成的菌絲球吸附并固定產(chǎn)氫細菌——產(chǎn)酸克雷伯氏菌進行連續(xù)流產(chǎn)氫，解決了產(chǎn)氫菌流失和產(chǎn)氫速率降低的問題，實現(xiàn)了霉菌和功能菌的生態(tài)位分離，將各自的功能有機地結合到了一起.但是，考慮到采用吸附法向菌絲球上固定化微生物的方法操作步驟繁瑣、耗時、固定微生物量有限、形成的混合菌絲球內部微生物分布不均勻，勢必影響固定化微生物的活性和整個球體的傳質效果.本實驗為菌絲球這種新型生物質載體提出了一種新的固定化方法——同時培養(yǎng)法，并以高效低溫苯胺降解細菌JH-9作為研究對象，對同時培養(yǎng)和吸附兩種固定化方法作了對比研究，為混合菌絲球的實際應用提供了有力的理論基礎.

1 實驗

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器和試劑

用于本試驗的設備主要為8037—SGS超型全自動壓力蒸汽滅菌器、ZHWY—2112B型雙層全溫度恒溫振蕩器、紫外分光光度儀(UNICAMHEλIOS)、CX31型顯微鏡、電子天平(ALC-210.4)、顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)、垂直流超凈工作臺、鼓風干燥箱、石蠟切片機.

1.1.2 菌種來源

1.2 實驗方法

1.2.1 單純霉菌菌絲球的培養(yǎng)

配置液體培養(yǎng)基，121℃，滅菌20 min，接種孢子懸液，于160 r/min、37℃的搖床中培養(yǎng)24 h.

1)菌絲球生長培養(yǎng)基成分.蔗糖30 g，NH4Cl 0.5 g，K2HPO3·H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，H2O 1 000 mL.

2)孢子懸液的配置.用無菌的生理鹽水沖洗長有曲霉菌的斜面固體培養(yǎng)基的表面，用接種環(huán)輕刮斜面，直至菌體被完全沖洗下來.輕輕震蕩試管，使懸液中的孢子呈均勻分散狀態(tài).用可見分光光度計在波長620 nm下測其吸光度(A)．

3)菌絲碎片的制備.用量筒取球齡4 d的菌絲球，靜置30 min.使菌絲球充分沉降，量取量筒底部沉降下來的菌絲球150 mL，用無菌水稀釋至300 mL倒入粉碎機中1 800 r/min，粉碎30 s，制成混合均勻的菌絲片段懸液.

1.2.2 混合菌絲球培養(yǎng)方案

取低溫條件下的JH-9培養(yǎng)液在12 000 r/min下離心5 min，然后棄離心上清液，用磷酸鹽緩沖溶液清洗離心管底部的菌體，在上述條件下再次離心，如此操作兩次.洗菌后將離心管底部的菌體取出，用適量無菌水配成均勻菌懸液.按照菌絲球片段繁殖和孢子繁殖這兩種不同的繁殖方法，分別采取同時和先后接種的方法培養(yǎng)混合菌絲球，并以不接種JH-9細菌的單純菌絲球作為對照(具體實驗設計方案見表1).

煤全部燒光了；煤桶空了；煤鏟也沒有用了；火爐里透出寒氣，灌得滿屋冰涼。窗外的樹木呆立在嚴霜中；天空成了一面銀灰色的盾牌，擋住向蒼天求助的人。我得弄些煤來燒；我可不能活活凍死；我的背后是冷酷的火爐，我的面前是同樣冷酷的天空，因此我必須快馬加鞭，在它們之間奔馳，在它們之間向煤店老板要求幫助。

表1 混和菌絲球培養(yǎng)方案

1.2.3 菌絲球直徑的測定

隨機選取10個菌絲球，用濾紙吸去菌絲球外表面水分.吸取的水分應適量，保證菌絲球不因失去過多水分而變形.然后以游標卡尺量取直徑數(shù)值.菌絲球直徑表示為10個菌絲球直徑的平均值.

1.2.4 成球堆積體積測定方法

將250 mL三角瓶中的菌絲球培養(yǎng)液倒入一個200 mL量筒中，靜置10 min，讀取菌絲球沉降體積作為成球堆積體積.

1.2.5 菌絲球形態(tài)觀察

將接種后的液體培養(yǎng)基置于160 r/min，37℃搖床培養(yǎng)，當菌絲球培養(yǎng)到直徑1～2 cm時，將菌絲球接入培養(yǎng)皿中用數(shù)碼照相機拍照觀察外觀形態(tài)，而后將菌絲球切開用掃描電子顯微鏡觀察其微觀菌絲形態(tài)和混合菌絲球生態(tài)構成.

1.3 實驗過程

1.3.1 不同固定化方法對混合球成球速度的影響

將霉菌Y3和菌株JH-9分別以同時接種培養(yǎng)(向培養(yǎng)液中同時接種Y3和JH-9)和吸附法培養(yǎng)(在培養(yǎng)液中先接種Y3待培養(yǎng)48 h菌絲球形成時向培養(yǎng)液中接種JH-9)的方式形成混合菌絲球，兩種接種方式中霉菌Y3初始的接種量相等，而工程菌JH-9的初始接種量分別為5、10、20 mL(母液細菌量1.2×109/mL).每隔8 h測定培養(yǎng)液的吸光度A．

1.3.2 不同固定化方法對混合菌絲球成球堆積體積的影響

按照1.3.1中所述的兩種方法進行固定化，培養(yǎng)混合菌絲球.當培養(yǎng)液的吸光度值A降為0時，將培養(yǎng)液中混合菌絲球移至量筒，靜止沉降30 min后測量全部菌絲球堆積體積，本實驗以單純霉菌菌絲球作對照.

1.3.3 不同培養(yǎng)方法對混合菌絲球成球大小的影響

按照1.3.1所述的兩種方法進行固定化，培養(yǎng)混合菌絲球.當培養(yǎng)液的吸光度值A降為0時，隨機各取不同固定化方法形成的混合菌絲球10個，分別測量其直徑d的大小，取其平均值作為菌絲球的大小(這里所指成球大小即菌絲球的直徑d)．

1.3.4 不同培養(yǎng)法對混合菌絲球總質量和相對密度的影響

按照1.3.1中所述的兩種方法進行固定化，培養(yǎng)混合菌絲球.當培養(yǎng)液的吸光度值A降為0時，將不同固定化方法形成的全部混合菌絲球從三角瓶中取出，去除多余水分(吸取量控制在不使菌絲球變形為宜)后放至已恒重的蒸發(fā)皿中，置于烘箱，95℃烘干至恒質量，讀取皿和球的總質量，去掉空皿質量得到混合菌絲球的總質量.成球總相對密度定義為成球總質量除以成球堆積體積.

1.3.5 混合菌絲球內部形態(tài)觀察

采用同時培養(yǎng)法和吸附法培養(yǎng)混合菌絲球，隨機取兩種混合菌絲球各1個，切開后在掃描電子顯微鏡下觀察其內部形態(tài)結構，同時以沒有固定化細菌的單純霉菌菌絲球內部形態(tài)結構作對比.

2 結果分析

2.1 不同固定化方法對混合菌絲球成球速度的影響

將霉菌Y3和功能菌JH-9分別以同時培養(yǎng)(向培養(yǎng)液中同時接種Y3和JH-9)和吸附法培養(yǎng)(在培養(yǎng)液中先接種Y3待培養(yǎng)48 h菌絲球形成時向培養(yǎng)液中接種JH-9)的方式形成菌絲球，兩種接種方式中霉菌Y3初始的接種量相等，而功能菌JH-9的初始接種量分別為5、10、20 mL(母液細菌量1.2×109/mL).每隔8 h測定培養(yǎng)液的吸光度A．如圖1、2所示，不論同時培養(yǎng)法還是吸附法，培養(yǎng)液的吸光度值自接種時起一直持續(xù)降低，最后降為0.不同接種量的同時培養(yǎng)法培養(yǎng)液吸光度值都在72 h降為0.而吸附法只有接種5 mL菌液的培養(yǎng)液在培養(yǎng)72 h時吸光度值降為0.同時培養(yǎng)法固定化細菌的時間比先后接種法要短.將培養(yǎng)液吸光度降為0視為混合菌絲球成球完全，以單位時間內培養(yǎng)液吸光度值A減少量V來表示混合菌絲球的成球速度，將以上數(shù)據(jù)重新整理，以混合菌絲球成球速度成圖，結果如圖3所示.

圖1 同時培養(yǎng)法不同接種量對成球的影響

圖2 吸附法不同接種量對成球的影響

圖3 不同固定化方法對混合菌絲球成球速度的影響

由圖3可以看出，隨著JH-9接種量的增加混合菌絲球的成球速度逐漸提高，即霉菌數(shù)量一定時，混合菌絲球的成球速度與功能菌的接種量成正比.JH-9接種5 mL時，同時培養(yǎng)法成球速度小于先后接種培養(yǎng)法;JH-9接種10 mL時，同時培養(yǎng)法與吸附法成球速度基本相等;JH-9接種20 mL時，同時培養(yǎng)法成球速度明顯大于吸附法.這說明在相同的培養(yǎng)條件下同時培養(yǎng)法能夠以更快的速度固定化更多的細菌，其單位時間內固定化細菌量更多.

2.2 不同固定化方法對混合菌絲球成球堆積體積的影響

當培養(yǎng)液吸光度降為0以后，將培養(yǎng)液中混合菌絲球取出以量筒測量全部菌絲球堆積體積，以單純霉菌菌絲球作對照，結果如圖4所示.可以看出，隨著JH-9接菌量的增多，最終形成混合菌絲球的體積也增多，即混合菌絲球的堆積體積與功能菌的接種量成正比.同時培養(yǎng)法比吸附法所形成的混合菌絲球堆積體積略大一些.

2.3 不同固定化方法對混合菌絲球成球大小的影響

隨機各取不同固定化方法形成的混合菌絲球10個，分別測量其直徑大小，再取平均值作為菌絲球的平均大小.不同固定化方法形成的混合菌絲球成球大小如圖5所示，可以看出，相同接種量的條件下，同時培養(yǎng)法形成的混合菌絲球直徑比吸附法的小，且成球總數(shù)量多.接種方法相同時，混合菌絲球的大小隨著接種細菌數(shù)量的增多而變大.

圖4 不同固定化方法對混合菌絲球成球堆積體積的影響

圖5 不同固定化方法對混合菌絲球成球大小的影響

2.4 不同固定化方法對混合菌絲球總質量和總相對密度的影響

將不同固定化方法形成的全部混合菌絲球從三角瓶中取出，盡量去除多余水分后放到已經(jīng)恒重的蒸發(fā)皿中，吸取量控制在不使菌絲球變形為宜，將處理好的菌球置于烘箱內，95℃烘干至恒質量，讀取皿和球的總質量，去掉空皿質量得到混合菌絲球的總質量.以成球總質量除以成球堆積體積即定義為成球總相對密度.

由圖6可以看出，當細菌接種量相同時，同時培養(yǎng)法形成的混合菌絲球的總質量和總相對密度都要小于吸附法形成的混合菌絲球;而相同固定化方法，隨著細菌接種量的增加形成混合菌絲球的總質量和總相對密度卻減少.

圖6 不同固定化方法對混合菌絲球成球總質量和密度的影響

2.5 不同固定化方法對混合菌絲球內部形態(tài)的影響

分別采用同時培養(yǎng)法和吸附法培養(yǎng)混合菌絲球，隨機取兩種混合菌絲球各1個，切開后在掃描電子顯微鏡下觀察其內部形態(tài)結構，同時以沒有固定化細菌的單純霉菌菌絲球內部形態(tài)結構作對比，結果如圖7所示.可以看出:圖7(a)中采用吸附固定化方法形成的混合菌絲球內部的細菌只固著在菌絲交叉形成平臺的地方，而在沒有交叉的菌絲上就沒有細菌存在;而圖7(c)中采用同時培養(yǎng)固定化方法形成的混合菌絲球內部，細菌是非常均勻地排列生長在每一根菌絲上，無論菌絲交聯(lián)與否，而且單位面積上固定化生長的細菌數(shù)量也明顯多于圖7(a)的混合菌絲球.而且，圖7(c)中細菌均勻排列，很少出現(xiàn)堆積和分層的現(xiàn)象，不影響菌絲球內部的能量和氧的供給，不會影響菌絲球對內部細菌的傳質，這樣被固定的細菌就能夠保持較高的活性，更有利于在水處理工藝中的應用.

圖7 不同固定化方法形成的混合菌絲球內部形態(tài)結構的掃描電子顯微鏡照片

3 結論

1)相同接種量的條件下，同時培養(yǎng)法固定化細菌所用的固定化時間縮短，而且在單位時間內可固定化細菌量更多.同時培養(yǎng)法與吸附法所形成的混合菌絲球相比，其堆積體積更大，成球總數(shù)量更多，球體直徑較小，總質量和總相對密度也較小.

2)當采用同一種固定化方法時，混合菌絲球的堆積體積、成球大小與功能菌的接種量成正比;而形成混合菌絲球的總質量和總相對密度卻與功能菌的接種量成反比.

3)同時培養(yǎng)法形成的混合菌絲球內部細菌非常均勻地排列生長在每一根菌絲上，無論菌絲交聯(lián)與否;而吸附法形成的混合菌絲球內部，細菌只存在于多條菌絲交叉形成平臺的地方.所以，新型微生物固定化方法可能會有效解決傳統(tǒng)方法的傳質效率低、固定生物量低、成本高等問題，具有較大的開發(fā)潛力和應用價值.

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