全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀在血紅蛋白分析中的應(yīng)用

阮麗明，周艷潔，丁進(jìn)龍，梁立陽，何桂瓊，梁 蕭，蘇國(guó)生

（1.南寧市人口和計(jì)劃生育服務(wù)中心，廣西 南寧 5300222.南寧市第四人民醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

血紅蛋白病可分為異常血紅蛋白病和地中海貧血（地貧），地中海貧血是我國(guó)南方最常見和危害最大的遺傳病之一[1-2]，廣西是地貧的高發(fā)區(qū)[3]。根據(jù)地貧病變發(fā)生的珠蛋白鏈不同可分為α地貧和β地貧。分離量化和鑒定患者的血紅蛋白成分對(duì)于地貧各種類型的臨床診斷及治療具有重大意義。毛細(xì)管血紅蛋白電泳能夠定量檢測(cè)血紅蛋白A(HbA)、血紅蛋白F-(HbF)、血紅蛋白A2(HbA2)含量以及其他異常血紅蛋白，可用于診斷地中海貧血及其他血紅蛋白病[4]。為了解全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀在血紅蛋白分析中的臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究針對(duì)5088例項(xiàng)目人群進(jìn)行電泳分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年1～9月，對(duì)分布在南寧市6城區(qū)及所轄6縣（共96個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)）的5457對(duì)（10914人）年齡20～40歲（廣西籍10907人、廣東籍5人、四川籍2人）的農(nóng)村新婚夫婦進(jìn)行地貧篩查。對(duì)篩查人群中血常規(guī)一方或雙方異常[紅細(xì)胞平均體積（MCV）＜80 fl]的5088例進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，并選出229例做地貧基因分析。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集及處理 用一次性真空采血管（含EDTAK2抗凝劑）采集上述人群靜脈血2～3 ml，搖勻抗凝。

1.2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳 采用法國(guó)Sebia公司生產(chǎn)的Cap2illarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀（The Capillary Sebia，Parc Leonard de Vinci，CP 8010 Lisses，91008 EVRY，F(xiàn)rance）（法國(guó)Sebia公司6.11軟件版本Capillarys@）及其配套血紅蛋白電泳試劑盒CAPILLARYSHEMOGLOB IN（E）。（CAT No.19096、09107、12037）。按照儀器操作說明書進(jìn)行，抗凝標(biāo)本直接離心取沉淀紅細(xì)胞加入試管中（標(biāo)本量＞200μl）。把裝有標(biāo)本的試管按順序放在儀器配套的檢測(cè)架上（一個(gè)檢測(cè)架一次一批可檢測(cè)7個(gè)標(biāo)本，可同時(shí)檢測(cè)多批標(biāo)本），在檢測(cè)架第八管位置加入大約4 ml的溶血試劑。把檢測(cè)架送入Cap illarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行血紅蛋白電泳檢測(cè)，約30 min后全部檢測(cè)程序完畢，查看結(jié)果。

1.2.3 質(zhì)控品準(zhǔn)備 取SEB IA公司提供的正常HbA2質(zhì) 控 品[（SEBIA，PN 4778）CAT No.25055、21105）]。用1 ml蒸餾水或去離子水溶解，把溶解的質(zhì)控品加入一個(gè)微型試管中。除去微型試管管帽。把此微型試管放入一個(gè)作為底座的新溶血試管，放置于樣品架No.0的1號(hào)位置，按上述標(biāo)本步驟測(cè)定。

1.2.4 基因檢測(cè) 3種常見缺失型α地貧基因分析采用Gap-PCR技術(shù)，3種非缺失型α地貧基因和17種β地貧基因分析采用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（RDB），用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司生產(chǎn)的全血基因組提取試劑盒和基因診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分布范圍的統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。

2 結(jié)果

2.1 血紅蛋白電泳的檢測(cè)結(jié)果 10914人中對(duì)MCV＜80 fl的5088例標(biāo)本進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)異常1042例，其中β地貧757例（HbA2＞4.0%），HbF增高23例，HbCS262例，見表1。

表1 毛細(xì)管電泳異常結(jié)果

5088例標(biāo)本中選出229例同時(shí)進(jìn)行毛細(xì)管電泳和地貧基因檢測(cè)，以基因?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，比較毛細(xì)管電泳篩查α和β地中海貧血中常見異常區(qū)帶的符合率。229例標(biāo)本基因檢測(cè)結(jié)果：正常有50例，β地中海貧血74例，異常血紅蛋白E(HbE)7例、血紅蛋白H(HbH)病46例、異常血紅蛋白(HbCS)40例。以上病例的毛細(xì)管電泳分析顯示每個(gè)血紅蛋白顯示的鋒都出現(xiàn)在特定的區(qū)域：HbCS=Z2、HbA2=Z3、HbE=Z4、HbF=Z7、HbA=Z9、HbH=Z15、血紅蛋白 Bart's(Hb-Bart's)=Z12。

2.2 毛細(xì)管電泳對(duì)β地中海貧血及異常HbE的篩查β地貧患者毛細(xì)管電泳HbA2（Z3）74例都出現(xiàn)增高，其中59例伴有HbF增高（見表2）。7例HbE存在時(shí)，同樣可對(duì)HbA2定量（見圖1）。

2.3 毛細(xì)管電泳對(duì)α地中海貧血中異常區(qū)帶的篩查 46例HbH病電泳中出現(xiàn)HbH區(qū)帶（Z15）23例，HbH+HbBart's區(qū)帶18例，合并有HbCS區(qū)帶（Z2）4例（見圖2）；有1例HbH病在電泳檢測(cè)中漏診，與基因結(jié)果符合率為97.83%，這1例的基因型為-SEA/-α 3.7。Hb Constant Spring（HbCS）雜合子40例中有2例未檢出，與基因符合率為95.00%（見表3）。

表2 毛細(xì)管電泳對(duì)β地中海貧血及HbE雜合子測(cè)定結(jié)果（±s，%）

表2 毛細(xì)管電泳對(duì)β地中海貧血及HbE雜合子測(cè)定結(jié)果（±s，%）

類型 例數(shù)HbF HbA 2 HbE 與基因符合率β地貧HbE雜合子747 1.2±1.0（59例）5.3±1.14.0±0.4724.3±3.2100100

表3 HbH病及HbCS雜合子電泳結(jié)果分析（±s,%）

表3 HbH病及HbCS雜合子電泳結(jié)果分析（±s,%）

類型HbH病HbCS雜合子例數(shù)4538 HbH 4.3±3.3(23例）-HbBart's 1.4±1.0（18例）-HbA 2 1.0±0.22.2±0.2 HbCS 3.5±0.4（4例）0.77±0.78與基因符合率97.8395.00

圖1 HbE雜合子（βE）HbF：0.9%，HbE26.5%，HbA2：3.8%

圖2 HbH?。?-SEA/aaCS）HbH：6.3%，HbBart`s：1.5%HbCS：3.2%

3 討論

全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法是在充滿電泳液的石英毛細(xì)管中進(jìn)行電泳的技術(shù)，在溶血試劑中進(jìn)行稀釋的紅細(xì)胞樣品，會(huì)被注射到毛細(xì)管的負(fù)極端，在高壓電的作用下競(jìng)相電泳分離，然后Hb會(huì)被靠近正極端的415 nm光波檢測(cè)裝置檢測(cè)到[5]。通過毛細(xì)管電泳將蛋白質(zhì)分離，采用波長(zhǎng)為200 nm氘光源和CCD探測(cè)器，對(duì)血紅蛋白成分分析靈敏度和分辨率高[6]。我們對(duì)法國(guó)Sebia公司Cap illarys 2全自動(dòng)毛細(xì)血管電泳系統(tǒng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證明該系統(tǒng)具有較高的精密度及準(zhǔn)確度。直接檢測(cè)可準(zhǔn)確地對(duì)各種血紅蛋白組份相對(duì)定量，尤其是那些重要的組份，例如HbA、HbA2、HbE、HbF、HbH、HbBart's、HbCS。在α地貧中，成人用毛細(xì)管血紅蛋白電泳方法檢出的異常區(qū)帶有HbH、HbBart's和HbCS，HbH病和HbCS與基因分析的符合率為97.83%和95.00%，漏診的主要原因可能與不穩(wěn)定血紅蛋白的降解有關(guān)。β地貧主要表現(xiàn)為HbA2、HbF增高，毛細(xì)管電泳與基因基因診斷結(jié)果吻合。HbE是由β珠蛋白基因第26位的谷氨酸被賴氨酸取代所產(chǎn)生，是一種β地貧樣的血紅蛋白病[7]。HbE存在時(shí)，同樣可對(duì)HbA2定量。毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)血紅蛋白變異體的分辨效果好，用此方法分離血紅蛋白，可對(duì)與α地中海貧血相關(guān)的血紅蛋白血癥進(jìn)行鑒別診斷[8-9]。全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法且具有樣品處理簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)[10]。所以我們認(rèn)為全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法基本可以為地中海貧血及血紅蛋白病篩查及診斷提供快速準(zhǔn)確的診斷依據(jù)。但在實(shí)際應(yīng)用過程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①標(biāo)本采集后應(yīng)在7 d內(nèi)完成測(cè)定，電泳前放置冰箱2℃～8℃保存，否則對(duì)HbCS、HbH、Hb Bart's等的不穩(wěn)定的血紅蛋白易造成降解。②毛細(xì)管電泳分析無法檢出α地貧-1和α地貧-2，所以對(duì)血常規(guī)Hb、MCV、MCH降低的患者，在排除缺鐵性貧血、自身免疫性溶血等因素后，HbF、HbA2值正常且未檢出異常區(qū)帶者，應(yīng)做分子生物學(xué)檢測(cè)地貧基因來排除輕型α地貧患者。③對(duì)電泳出現(xiàn)有A2變異體或其他異常血紅蛋白的標(biāo)本可以結(jié)合軟件中給出的區(qū)帶提示去初步分析和判斷，對(duì)異常區(qū)帶的最后診斷要進(jìn)行基因分析測(cè)序確認(rèn)。

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