病理性疼痛和脾切除手術對老年雄性大鼠海馬細胞膽堿乙酰轉移酶和細胞凋亡的不同影響

朱雅斌，孫燦林，謝國柱，錢濤，姜琳

(泰州市人民醫院麻醉科，江蘇泰州225300)

病理性疼痛和脾切除手術對老年雄性大鼠海馬細胞膽堿乙酰轉移酶和細胞凋亡的不同影響

朱雅斌，孫燦林，謝國柱，錢濤，姜琳

(泰州市人民醫院麻醉科，江蘇泰州225300)

目的探討病理性疼痛和脾切除術對老年雄性大鼠海馬細胞膽堿乙酰轉移酶和細胞凋亡的不同影響及其機理。方法選擇60只老年雄性大鼠，隨機分為3組，A組單純麻醉，只給予麻醉處理(單純麻醉組)；B組在左側大腿中部切開，暴露坐骨神經后用4-0絲線結扎4道，常規縫合皮膚(CCI組)；C組給予脾切除手術之后常規縫合傷口(脾切除組)。三組再按術前1 d、術后1 d、7 d、14 d 4個時間點，將每組再分為4個小組(n=5)。分別為：A1、A2、A3、A4，B1、B2、B3、B4，C1、C2、C3、C4，在術前1 d和術后1 d、7 d、14 d按時間點經10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開胸經升主動脈依次灌注生理鹽水100 ml和4%多聚甲醛-PBS復合液300 ml后，開顱取腦，石蠟切片后分別進行HE和CHAT免疫組化染色，光鏡下觀察海馬組織細胞形態變化。結果HE染色顯示CCI組錐體層細胞損傷重，有較多凋亡形態細胞出現，高峰在術后14 d，脾切除組錐體層和顆粒層均有損傷，出現細胞減少，形態改變；CHAT免疫組化染色3組均有CHAT陽性細胞數的減少，術后7 d、14 d CCI組較脾切除組染色明顯偏淺。結論病理性疼痛和脾切除組造成海馬細胞損傷的位置和程度不同，可能存在不同的機制。

疼痛；脾切除；膽堿乙酰轉移酶；細胞凋亡

手術刺激是造成術后患者認知功能障礙的重要因素，大腦海馬細胞在認知中扮演著重要角色，認知功能障礙與海馬突觸可塑性改變密切相關，包括突觸結構和功能的可塑性[1]，因此海馬的損傷是衡量認知功能障礙的重要指標。但是，由于手術種類繁多，各類手術刺激造成的海馬細胞凋亡機制是否均相同目前尚不清楚。本課題選取坐骨神經慢性壓迫(CCI)疼痛模型和脾切除模型造成雄性老齡大鼠認知障礙，觀察兩種手術類型造成海馬細胞凋亡的表像是否相同并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料選用18～20個月齡的SD大鼠經篩選剔除體重過大或過輕及在水中不游動者，共選出動物60只，體重450～500 g。參照隨機數字表，60只大鼠隨機分為3組，樣本量根據統計學估算得出。A組：單純麻醉組；B組：CCI組；C組：脾切除組。各組再根據術前1 d、術后1 d、7 d、14 d 4個時間點再分為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4共12個組。

1.2 實驗方法建立模型前均采用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，局部消毒。A組給予麻醉處理，常規喂養，僅作對照；B組采用Bennett等[2]的方法于大鼠左側大腿中部切開，暴露坐骨神經，在其分叉處用4-0絲線間隔1 mm松扎4道，逐層縫合；C組大鼠行脾切除術，之后以1#絲線關腹。手術傷口均常規覆以青霉素粉末，術后未有感染發生。造模之后1 d、7 d、14 d予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，先經左心室向升主動脈注射肝素0.l ml抗凝，再依次灌入生理鹽水(4℃)約100 ml、PBS液-多聚甲醛混合液(pH 7.4，4℃)300 ml；然后開顱取腦，剝離海馬，標本在PBS液-多聚甲醛混合液(pH 7.4，4℃)中浸泡48 h。各組動物取左側腦組織石蠟包埋切片。以能切取的海馬最大面為中心，行5 μm連續冠狀面切片，每只鼠取4張切片。取間隔的兩張做HE染色觀察大體變化；右側腦組織行30 μm連續冠狀面切片，取兩張片做膽堿乙酰轉移酶(CHAT)免疫組化。

1.3 統計學方法采用SPSS11.5統計學軟件，方法采取完全隨機設計的方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠海馬CA3區錐體細胞HE染色HE染色顯示，CCI組和脾切除組在術后1 d、7 d、14 d均有明顯的細胞數減少，和A1組比較，B組1 d、7 d、 14 d和C組1 d、7 d、14 d均有明顯細胞數減少(P＜0.05)，B組術后14 d和術后1 d相比減少明顯(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠海馬CA3區錐體細胞HE染色40×10倍鏡下計數(個，n=5,)

表1 三組大鼠海馬CA3區錐體細胞HE染色40×10倍鏡下計數(個，n=5,)

注：和A1組比較，#P＜0.05；和A1組比較，*P＜0.05；和A1組比較，△P＜0.05；和A3、A4組比較，◆P＜0.05；和B2組比較，*◆P＜0.05。

組別細胞數組別細胞數組別細胞數A1組A2組A3組A4組58.60±2.51 50.60±3.58#51.80±6.06 48.60±4.15 B1組B2組B3組B4組59.80±3.27 50.80±5.07*45.60±5.13*34.80±6.65*◆C1組C2組C3組C4組60.40±3.21 45.60±6.80△49.80±4.92△48.00±5.83

2.2 三組大鼠海馬細胞CHAT免疫組化染色陽性細胞數比較單純麻醉組CHAT含量沒有明顯減少，CCI組術后1 d、7 d、14 d逐漸減少，術后1 d、7 d、14 d CHAT陽性細胞數均少于A1組(P＜0.05)，脾切除組術后1 d CHAT陽性細胞數最少(P＜0.05)，術后7 d、14 d逐漸恢復，見表2。

表2 三組大鼠海馬細胞CHAT免疫組化染色陽性細胞數(個，n=5,)

表2 三組大鼠海馬細胞CHAT免疫組化染色陽性細胞數(個，n=5,)

注：和A1組比較，#P＜0.05。

A1組A2組A3組A3組59.20±3.27 44.40±5.86#50.00±7.91 54.40±5.41 57.60±6.58 53.00±8.03 59.80±3.70 57.80±5.54 B1組B2組B3組B4組59.00±2.92 50.00±5.61 44.80±8.07#36.80±6.30#C1組C2組C3組C4組

2.3 HE染色結果染色顯示CCI組和脾切除組術后14 d海馬細胞出現較明顯的細胞數量減少，且多數細胞核深染明顯減少，見圖1。

圖1 術后14 d HE染色結果

2.4 術后14 d膽堿乙酰轉移酶(CHAT)免疫組化染色結果CHAT免疫組化染色顯示CCI組和脾切除組術后14 d CHAT陽性細胞數量明顯減少，且B組減少更明顯，說明海馬區膽堿乙酰轉移酶數量明顯減少，見圖2。

圖2 術后14 d膽堿乙酰轉移酶(CHAT)免疫組化染色結果

3 討論

CCI組術后1 d、7 d、14 d的細胞數明顯少于術前1 d(P＜0.05)，并且14 d損傷最重，細胞丟失最多。脾切除組術后1 d組可觀察到細胞減少，和術前相比差異有統計學意義(P＜0.05)，說明脾切除可以造成大鼠大腦海馬細胞的減少，但是在術后7 d、14 d細胞數相對穩定,大腦海馬細胞損傷較CCI組輕。

HE染色顯示，CCI組和脾切除組對于海馬細胞的損傷部位有所區別，CCI組主要損傷CA3區錐體層細胞，表現為術后14 d細胞數量減少，層次不清，可見較多凋亡形態細胞，可達60～70個/40×10倍鏡，細胞體積普遍縮小、大小不一、形態不規則，胞漿紅染，胞核皺縮，輪廓模糊不清，顆粒層細胞基本保持完好。脾切除組對于錐體層和顆粒層細胞均有損傷，并且顆粒層細胞損傷更重，均出現了細胞數量減少，凋亡細胞出現，表現為細胞體積縮小，細胞皺縮，輪廓模糊，錐體層凋亡樣細胞有24～38個/40×10倍鏡下，顆粒層達到138個/40×10倍鏡。足夠的錐體層神經元去極化后激活谷氨酸受體NMDA亞型，通道打開，Ca2+離子內流，細胞內Ca2+增加觸發一系列反應，引發LTP (長時程增強)促進學習和記憶[1]。CCI組的認知障礙主要是疼痛引起的應激造成海馬CA3區錐體神經元細胞萎縮。應激反應促進酸性氨基酸釋放，通過間接興奮齒狀回顆粒細胞而損傷CA3區神經元。其次，CA3區錐體細胞缺乏鈣結合蛋白D28k和小清蛋白，而齒狀回神經元主要是顆粒細胞層則具有鈣結合蛋白，鈣超載是造成神經細胞損傷的重要原因，鈣結合蛋白對神經細胞有一定的保護作用，所以顆粒細胞相對于錐體細胞不容易被損傷，這使得CA3區錐體細胞在應激時更容易被損傷。糖皮質激素在慢性應激中的作用可能是加強酸性氨基酸對CA3錐體細胞的損傷效應[3]。脾切除組對海馬細胞錐體層和顆粒層均有損傷有可能是由于脾切除對大鼠神經系統的短期影響更大造成的。

CHAT免疫組化分析表明，CCI模型組從術后1 d開始陽性細胞數開始下降，一直持續到術后14 d，脾切除組術后1 d下降最明顯，之后緩慢恢復。乙酰轉移酶CHAT是腦內膽堿能系統中的重要的酶類，反映了中樞神經系統乙酰膽堿的活性，乙酰膽堿系統與學習記憶能力關系密切。本次實驗證明病理性疼痛比麻醉和脾切除手術對海馬細胞的影響強烈并且持續時間長，這可能和神經病理痛的高峰發生在造模后12～14 d有關[4-5]。

由此可見，CCI組和脾切除組造成術后認知功能障礙的機制可能有所不同，除了兩者都影響海馬細胞CHAT的含量外，病理性疼痛引起大腦海馬錐體細胞的凋亡和缺失造成認知障礙，而脾切除手術則同時影響錐體層和顆粒層細胞，造成認知障礙。

[1]陳誼,蔡文瑋,盛凈.糖尿病模型大鼠認知功能障礙及海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體表達變化[J].實用醫學雜志,2010,26 (17)：3098-3101.

[2]Bennett GJ,Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J]. Pain,1988,33(1)：87-107.

[3]Watanabe Y,Gould E,McEwen BS.Stress induces atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3 pyramidal neurons[J].Brain Res, 1992,588(2)：341-345.

[4]Blackburn-Munro G,Fleetwood-Walker SM.The sodium channel auxiliary subunits[beta]1 and[beta]2 are differentially expressed in the spinal cord of neuropathic rats[J].Neuroscience,1999,90 (1)：153-164.

[5]Dickinson T,Mitchell R,Robberecht P,Fleetwood-Walker SM.The role of VIP/PACAP receptor subtypes in spinal somatosensory processing in rats with an experimental peripheral mononeuropathy[J]. Neuropharmacology,1999,38(1)：167-180.

Effect of pathological pain and splenectomy on choline acetyltransferase and apoptosis in hippocampus cells of aged male rats.

ZHU Ya-bin,SUN Can-lin,XIE Guo-zhu,QIAN Tao,JIANG Lin.Department of Anesthesiology,Taizhou Municipal People's Hospital,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the different effects of pathological pain and splenectomy on the choline acetyltransferase and the apoptosis in hippocampus cells of aged male rats,and to investigate the mechanisms.Methods Sixty aged male rats were divided into three groups：group A,group B and group C.The rats in group A were treated with anesthesia simply,and those in group B were cut in the middle of the left thigh,and ligated 4 times with 4-0 silk thread after the exposure of sciatic nerve,with the skin sutured routinely then.Rats in group C were given spleen surgery and routine suture of the skin.The three groups were each divided into 4 sub-groups according to different time points(one day before operation,1 day,7 days,14 days after operation),namelyA1,A2,A3,A4,B1,B2,B3,B4,C1,C2,C3,C4,with 5 rats in each sub-group.The rats in each group was anesthetized by 10%chloral hydrate at 4 time points,and then infused by 100 ml saline and 300 ml 4%POM-PBS composite though the ascending aorta.Craniotomied for brain,paraffin sections were carried out after HE and CHAT immunohistochemical staining.The changes of the hippocampus morphology were observed under a light microscope.ResultsIn HE staining revealed that pyramidal layer injured badly in group B,which reached the peak 14 days after the operation,with a lot of apoptotic cells.In group C,pyramidal layer and granular layer were both injured badly,with the number of cells reduced and the cell morphology changed.The number of positive cells reduced in the three groups in CHAT immunohistochemical staining.The dye color of group B was lighter than that in group C 7 days and 14 days after operation.ConclusionThe location and extent of the injury of the hippocampal cells caused by pathological pain and splenectomy were different,with different mechanisms.

Pain;Splenectomy;Choline;Acetyltransferase;Apoptosis

R-332

A

1003—6350（2012）24—017—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.24.007

2012-05-08)

朱雅斌(1980—)，男，內蒙古呼和浩特市人，住院醫師，碩士。