飼喂高濃度創(chuàng)傷弧菌對(duì)小鼠消化道的損傷研究

鄭晶，翁陽(yáng)，王明華

(海南醫(yī)學(xué)院病理教研室海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南海口571101)

飼喂高濃度創(chuàng)傷弧菌對(duì)小鼠消化道的損傷研究

鄭晶，翁陽(yáng)，王明華

(海南醫(yī)學(xué)院病理教研室海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南海口571101)

目的探討高濃度創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)經(jīng)食道感染小鼠的致病特點(diǎn)。方法22只昆明小鼠，實(shí)驗(yàn)組16只，均強(qiáng)制性喂食Vv菌液(4.2×1012cfu/ml)0.6 ml/只；對(duì)照組6只，喂食滅菌液體培養(yǎng)基(Marine broth 2216)0.6 ml/只。觀察小鼠一般情況，分別于實(shí)驗(yàn)后12 h及48 h采血并處死8只實(shí)驗(yàn)組小鼠和3只對(duì)照組小鼠，進(jìn)行血液的Vv分離培養(yǎng)并取其消化道及重要臟器組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果48 h組8只小鼠，有4只血培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性；Vv經(jīng)食道感染小鼠后導(dǎo)致其出現(xiàn)腹瀉等消化道癥狀，病理學(xué)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠食道及胃黏膜上皮部分缺損，小腸絨毛明顯水腫，結(jié)腸腸壁平滑肌溶解斷裂，消化道黏膜、黏膜下、肌層均可見(jiàn)不同程度的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；小鼠主要臟器也出現(xiàn)不同程度的損傷，以肺和腎臟的廣泛出血性損傷為主。結(jié)論(1)高濃度Vv經(jīng)食道進(jìn)入小鼠胃組織后能部分存活，并進(jìn)入腸道繁殖，從而引起小鼠腹瀉癥狀，損傷小鼠消化道組織，并可入血引發(fā)敗血癥，導(dǎo)致小鼠肺、腎等多臟器的和損傷，造成小鼠死亡。（2）Vv可經(jīng)消化道感染，所致炎癥性病變特點(diǎn)為蜂窩織性炎。

創(chuàng)傷弧菌；胃腸道；感染；蜂窩織炎

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)作為一種機(jī)會(huì)性致病弧菌，雖然自然存在于墨西哥灣、大西洋、太平洋海岸海水和海生物中，但其被人們所認(rèn)識(shí)的時(shí)間并不長(zhǎng)，曾被稱(chēng)為嗜鹽弧菌、嗜鹽性非霍亂弧菌、乳糖陽(yáng)性弧菌、海水弧菌等[1-2]。直到1979年，F(xiàn)armer[3]根據(jù)本菌的基本生化及形態(tài)特征認(rèn)為本菌應(yīng)屬嗜鹽弧菌群，并正式將其命名為Vv。很多臨床病例已經(jīng)證明，進(jìn)食受Vv污染的食物造成Vv感染后可引起嚴(yán)重的食物中毒癥狀，主要表現(xiàn)為原發(fā)性敗血癥進(jìn)而出現(xiàn)多臟器功能衰竭，這也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[4-6]。而由Vv單獨(dú)引起急性胃腸炎的病例卻少有有報(bào)道[7-8]。那么，經(jīng)消化道感染的細(xì)菌如何引起敗血癥呢？要闡明這一問(wèn)題，首先要揭示Vv對(duì)胃腸道本身的損傷作用如何。為此，我們?cè)诮v食源性感染的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)性研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏管理中心，菌株編號(hào)ATCC 27562。購(gòu)回后進(jìn)行冷凍干燥菌種的恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為Marine broth 2216，30℃恒溫培養(yǎng)24 h后應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。并用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法測(cè)得菌液濃度為4.2×1012cfu/ml。

1.2 動(dòng)物及分組SPF級(jí)6～8周齡昆明小鼠22只(雌雄各半)，由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)組16只，對(duì)照組6只。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組又各隨機(jī)分成兩組，分別為12 h組和48 h組，實(shí)驗(yàn)小鼠每組8只，對(duì)照小鼠每組3只。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠實(shí)驗(yàn)前均禁食12 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法1 ml注射器裝好已滅菌的小鼠灌胃針頭，強(qiáng)制飼喂小鼠。每只實(shí)驗(yàn)組小鼠被喂食1 ml的Vv懸液。同樣的方法給每只對(duì)照組小鼠飼喂1 ml滅菌的Marine broth 2216液體培養(yǎng)基。飼喂后密切觀察小鼠一般情況，包括毛發(fā)、精神狀態(tài)、進(jìn)食量和排便量及大便性狀。喂食后12 h，分別無(wú)菌剪斷實(shí)驗(yàn)12 h組8只小鼠及對(duì)照12 h組3只小鼠鼠尾，擠血一滴于滅菌的Marine broth 2216液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，陽(yáng)性者轉(zhuǎn)種Marine agar 2216固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行生化特性鑒定。采血后用斷椎法處死小鼠并解剖，取出消化道及主要臟器組織固定于10%中性福爾馬林固定液中，常規(guī)方法制成HE切片進(jìn)行病理學(xué)觀察。喂食后48 h，實(shí)驗(yàn)及對(duì)照48 h組小鼠處理方法同12 h組。

2 結(jié)果

2.1 一般情況實(shí)驗(yàn)組小鼠在喂食Vv懸液后均先后不同程度的出現(xiàn)了豎毛、少動(dòng)及進(jìn)食量減少的情況。在喂食10 h后，實(shí)驗(yàn)組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)排便次數(shù)增加及排稀便癥狀。12 h實(shí)驗(yàn)組小鼠無(wú)死亡，48 h實(shí)驗(yàn)組小鼠有3只死亡。對(duì)照組小鼠無(wú)明顯異常。

2.2 病理學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組16小鼠均出現(xiàn)了消化道不同程度的損傷，表現(xiàn)為：食道及胃黏膜上皮部分缺損，小腸絨毛水腫，消化道黏膜、黏膜下、肌層均可見(jiàn)不同程度的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及血管擴(kuò)張充血(圖1～圖4)；48 h組實(shí)驗(yàn)小鼠小腸絨毛水腫更為明顯，并出現(xiàn)結(jié)腸腸壁平滑肌溶解斷裂。實(shí)驗(yàn)組小鼠主要臟器也出現(xiàn)不同程度的損傷，死亡小鼠臟器損傷更為明顯，尤其以肺和腎臟的廣泛出血性損傷為主。

圖1 食道黏膜下層中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

圖2 胃肌層中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

圖3 小腸黏膜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

圖4 結(jié)腸黏膜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

2.3 分離培養(yǎng)果實(shí)驗(yàn)12 h組8只小鼠血培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。實(shí)驗(yàn)組48 h組小鼠死亡3只，未進(jìn)行血培養(yǎng)。5只死亡小鼠中有3只血培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性。

3 討論

創(chuàng)傷弧菌的感染途徑有兩種：一是經(jīng)消化道感染。生的或未熟透的貝甲類(lèi)海產(chǎn)品(尤其是牡蠣)是導(dǎo)致創(chuàng)傷弧菌食源性感染的主要傳播媒介，表現(xiàn)為原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌性敗血癥；二是通過(guò)皮膚傷口侵入，皮膚破損處接觸了含有Vv的海水后在原皮膚傷口處形成紅斑并劇烈疼痛，發(fā)展迅速，繼發(fā)敗血癥。Chang等[9]總結(jié)了18例Vv感染的臨床資料，其中14例為食源性的原發(fā)性敗血癥，4例為創(chuàng)傷感染。Klontz等[10]對(duì)62例創(chuàng)傷弧菌感染患者的流行病學(xué)資料進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)92%的原發(fā)性敗血癥患者和71%的感染創(chuàng)傷弧菌的患者均在1周內(nèi)有生吃過(guò)海鮮。1993年4月至1996年5月間，美國(guó)洛杉磯縣共報(bào)告了16例Vv食源性感染病例，其中12例(75%)患有肝病，所有患者都發(fā)展成敗血癥，并且在發(fā)病前1～2 d都吃過(guò)生牡蠣[11]。因此，經(jīng)消化道感染是臨床Vv感染性疾病的常見(jiàn)原因。并且食源性創(chuàng)傷弧菌感染引發(fā)的嚴(yán)重后果并不在于其引起的非特異性胃腸炎，而在于其引起的原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌性敗血癥，一旦出現(xiàn)敗血癥，其危害極大，往往會(huì)導(dǎo)致患者死亡。那么，經(jīng)消化道感染的細(xì)菌如何入血并引起敗血癥呢？要闡明這一問(wèn)題，首先要揭示Vv對(duì)胃腸道本身的損傷作用如何。筆者前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定數(shù)量的Vv經(jīng)食道感染小鼠后未引起相應(yīng)的消化道癥狀，對(duì)胃黏膜造成的損傷也表現(xiàn)為一過(guò)性和局限性[12]。Vv為嗜鹽性海生弧菌，最適合其生長(zhǎng)的鹽度為3%～6%，并適合在堿性環(huán)境中生長(zhǎng)。因此，進(jìn)入小鼠胃環(huán)境的Vv實(shí)際上大部分已喪失其正常的生物學(xué)活性。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將一次性飼喂小鼠的Vv懸液濃度大大提高，由4.7×107cfu/ml提高至4.2×1012cfu/ml，結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)了消化道癥狀及相應(yīng)的消化道損傷。這一結(jié)果表明，較多數(shù)量的Vv進(jìn)入胃組織后，部分細(xì)菌能夠在胃酸環(huán)境下存活并進(jìn)入腸道繁殖引起相應(yīng)病變。本實(shí)驗(yàn)中Vv感染引起的消化道損傷包括：食道及胃黏膜上皮部分缺損，小腸絨毛水腫，平滑肌斷裂溶解。已有研究表明，Vv產(chǎn)生的一系列胞外酶及毒素是其重要的毒力因素，例如金屬蛋白酶、細(xì)胞毒素及卵磷脂酶，它們分別與溶解膠原蛋白、細(xì)胞溶解及細(xì)胞線粒體膜的溶解密切相關(guān)[13-16]。Vv在局部繁殖釋放上述毒素及酶可能導(dǎo)致了小鼠消化道的相應(yīng)損傷。有關(guān)Vv感染所引起胃腸炎癥反應(yīng)特點(diǎn)的研究國(guó)內(nèi)外目前還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中值得注意的是Vv感染所引起的炎癥反應(yīng)特點(diǎn)：蜂窩織性炎，表現(xiàn)為消化道黏膜、黏膜下、肌層均可見(jiàn)不同程度的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，即中性粒細(xì)胞的彌漫浸潤(rùn)。胃腸道組織結(jié)構(gòu)較為疏松，而蜂窩織性炎就好發(fā)于結(jié)構(gòu)疏松的臟器和組織中。另外本研究中實(shí)驗(yàn)組小鼠主要臟器也出現(xiàn)不同程度的損傷，死亡小鼠臟器損傷更為明顯，且部分實(shí)驗(yàn)小鼠Vv血培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性。這說(shuō)明菌體能迅速通過(guò)受損的腸黏膜侵入血液，導(dǎo)致原發(fā)性Vv性敗血癥，并引起部分實(shí)驗(yàn)小鼠的死亡，這一結(jié)果亦與筆者前期的相關(guān)研究結(jié)果相同[17]。

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Pathogenicity of infections with Vibrio vulnificus in mice through the enteron.

ZHENG Jing,WENG Yang,WANG Ming-hua.Department of Pathology,Hainan Medical College,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the characteristics of infections through the alimentary canal with Vibrio vulnificus(Vv)in mice.Methods Twenty-two KM mice(SPF)were randomly divided into two groups,the study group (n=16)and the control group(n=6).The animal model of Vibrio vulnificus infections through the alimentary canal was established by feeding Vv inoculum(4.2×1012cfu/ml,strain 1.175 8)of 0.6 ml to each mouse in the study group.And the mouse in the control group was fed with sterile culture medium(Marine broth 2216).Eight mice in the study group and three mice in the control group were killed 12 h and 48 h after treatment.The Vv from the blood were cultured,and the pathological changes of the alimentary canal and other organs were observed under microscope.ResultsOf the eight mice killed 48 h after treatment,four showed positive blood cultures.In the study group,The gastric and esophagus mucosa was damnified with degeneration and necrosis of the epidermic cells.The edema of small intestinal villous was also observed.The neutrophil infiltration was observed in each layer of digestive tract.And different degrees of injury were also observed in the main viscera of the mice in study group,which is the most severe in lung and kidney. The pathological changes of lung and kidney were characterized by hemorrhagia,degeneration and necrosis of the cells.ConclusionThe injury of digestive tract could be induced by Vv in high concentration.Vv reproduction in digestive tract leads to primary septicemia,resulting in the death of the mice finally.Vv infection in digestive tract was characterized by Phlegmonous inflammation.

Vibrio vulnificus;Gastrointestinal tract;Infection;Phlegmonous inflammation

R-332

A

1003—6350(2012)09—024—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.09.009

2012-02-28)

海南省自然科學(xué)基金(編號(hào)：309036)

鄭晶(1979—)，女，湖北省黃岡市人，講師，博士。