突變型α-突觸核蛋白對大鼠原代培養神經元突起生長作用研究

王 鵬 許 潔 李 昕 何 欣 李堯華 于 順*

(1.北華大學基礎醫學院人體解剖學教研室，吉林132013;2.吉林化工學院理學院，吉林132022;3.首都醫科大學宣武醫院老年病研究所神經生物學研究室，北京100053)

神經退行性疾病(neurodegenerative disease)是一類以神經系統功能和結構逐步喪失和萎縮為特征的疾病，以阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)等為代表。PD是臨床上最常見的神經系統退行性疾病之一，表現呈進展性，目前臨床上尚無控制病程發展的有效措施，因此揭示這一疾病的機制，并采取早期診斷并預防顯得日益迫切。

PD的病理特征為黑質多巴胺能神經元發生變性壞死，以及路易小體(Lewy body)和路易軸索(Lewy neurite)的形成［1-2］。Lewy body 和 Lewy neurite 是纖維淀粉樣變的嗜酸性包涵體。人α-突觸核蛋白(αsynuclein，α-Syn)是參與形成淀粉樣變性的主要成分。α-Syn是一個具有140個氨基酸的蛋白質，主要分布于突觸前膜和核膜［3-5］。α-Syn與細胞的信號轉導有關，參與突觸形成、維持和神經元的分化，對突觸可塑性起一定的作用，但至今尚未完全清楚。為了闡明α-Syn在PD發病中的作用，有必要明確其生理功能。

體外實驗［6］證明，α-Syn能夠促進微管蛋白的聚合，加速微管的形成。在PD患者腦中，α-Syn被證明與γ-tubulin、tau蛋白以及MAP1B共存于Lewy body中，α-Syn可以促進原代培養的大鼠原代神經元的突起生長［7-9］。α-Syn與上述微管蛋白的密切關系及其潛在的促進微管形成的作用提示該蛋白有可能與神經元突起的形成和生長有關。本研究的目的是探討比較α-Syn和其突變體對神經元突起生長的影響，為揭示其突變體A53T和A30P導致PD發病的機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

BCA蛋白質定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)，購自 Pierce Biotech公司;α-Syn單克隆抗體3D5，由首都醫科大學宣武醫院神經生物研究室制備;FITC標記的羊抗鼠抗體，購自中山公司;細胞培養基DMEM(F-12)，購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)和馬血清(HS)，購自HyClone;蛋白相對分子質量標準，購自Pharmacia公司。其他均為化學分析純試劑。

1.2 實驗動物

新生24 h Wistar大鼠36只，雌雄不限，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，實驗動物許可證:SCXK-(軍)2002-001。

1.3 實驗方法

1)重組蛋白的制備與純化:將人α-Syn和其突變型 A53T、A30P的 cDNA分別插入表達載體 pET(3a)，然后轉化至BL21(DE3)感受態細胞，在含氨芐西林的YTA培養液中培養，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導重組蛋白表達。所表達的基因重組型蛋白采用離子交換層析和反向層析法純化。純化后的蛋白用SDS-PAGE法鑒定，BCA法定量。

2)原代神經元培養:按Kohn J Y等［10-11］創建的原代培養方法進行改良。將新生24 h大鼠斷頭，分離鼠腦，置于D-Hank's BBS中，剝去血管腦膜，分離皮質，剪碎。胰酶消化45 min后吹散，篩網過濾。800 r/min離心2 min后棄上清，細胞沉淀用DMEM培養基懸浮，計數細胞密度。以0.75×105個/皿的密度接種在用多聚賴氨酸包被好的培養皿(φ35 mm)中，加入相應蛋白進行分組培養。

3)神經元突起生長觀察和長度測量:培養至第1、2和4小時，向培養皿中添加終濃度為1%的戊二醛。室溫下固定1 h。隨機挑選30個視野進行拍照，每個視野至少有5個存活的神經元［12］。采用10倍目鏡，40倍物鏡，黑白，照片分辨率1 300×1 030，格式為TIFF。應用Image-Pro Plus V2.0軟件測量神經元突起的長度。

4)Western blotting法和免疫熒光法鑒定α-Syn的作用:將培養皿中的培養基吸棄，PBS沖洗。用細胞刮刮下細胞，超聲破碎。功率200W，30s 2次，間歇30 s。破碎后的細胞溶液加入 SDS-PAGE Running Buffer，沸水中煮 5 min。4 ℃，12 000 r/min，離心 20 min。轉移上清，取30 μL作為樣品，進行SDS-PAGE。電泳結束后，轉膜，脫脂奶溶液封閉，沖洗后，以1/1 000比例稀釋的3D5抗體反應過夜。洗膜，再與1/5 000稀釋的生物素標記的羊抗鼠抗體溶液反應。沖洗后，ECL法顯示條帶。

將培養細胞，以1%的戊二醛室溫下固定1 h后，PBS沖洗培養皿。以含10%羊血清的PBST溶液，室溫封閉1 h。棄封閉液，加入1/5 000稀釋的3D5抗體1.5 mL。4℃過夜，PBST沖洗。加入1/500稀釋的FITC標記羊抗鼠抗體，37℃，2 h;吸棄反應液，PBST沖洗。熒光顯微鏡下觀察照相。

5)培養分組方案:向原代神經元培養基中添加終濃度為 20 μmol/L 的 α-Syn、突變型 A53T、A30P 和BSA，培養至第1、2、4小時觀察。分別添加終濃度為20、40、60 和80 μmol/L 的相應蛋白，培養至4 h，觀察突起長度變化。

1.4 統計學方法

采用SPSS 12.0統計學軟件進行統計分析，所有數據均進行正態性檢驗，數據以均數±標準差(±s)表示。多組樣本均數比較采用方差分析(One-way ANOVA)，方差齊者兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者用TamhanepT2檢驗。兩組比較采用t檢驗。兩變量的相關分析采用Bivariate過程的Pearson直線相關法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組蛋白純化鑒定結果

SDS-PAGE鑒定，經親和層析得到純度較高的α-Syn 和 A53T、A30P，詳見圖 1。

2.2 α-Syn可促進神經元突起生長，A53T、A30P不能促進突起生長

圖1 純化后蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 Purification of α-Syn

添加α-Syn(20 μmol/L)以及其他蛋白進行分組培養，培養至1 h、2 h和4 h固定觀察。培養至1 h、2 h，添加α-Syn組的神經元突起平均長度大于對照組(P＜0.05)，而A53T組和A30P組與對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。培養至4 h，α-Syn組神經元突起長度明顯大于對照組(P＜0.01)，A53T組和A30P組與對照組之間差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖2。添加不同濃度(20～80 μmol/L)的各蛋白，培養至4 h觀察，α-Syn組突起長度隨濃度增加而增加，而A53T組和A30P組無變化，見圖3。可見α-Syn可以促進神經元突起生長，其突變型A53T、A30P對突起生長無影響。

圖2 α-Syn和其突變體對神經元突起生長的影響Fig.2 Effect of α-Syn，A30P and A53T promote on the neurite outgrowth

2.3 α-Syn可以從培養基進入神經元內，A53T和

A30P不能轉入神經元

α-Syn組神經細胞裂解液Western blotting結果現清晰條帶，為陽性;A30P、A53T和對照組均為陰性，圖4A。免疫熒光實驗結果顯示α-Syn神經元顯色清晰，在細胞內呈廣泛、均勻分布，對照組、A53T和A30P組為陰性，見圖4B。可見α-Syn可以從培養基進入神經元內，A53T和A30P不能進入神經元。

圖3 α-Syn組突起長度隨濃度變化情況Fig.3 α-Syn promotes neurite outgrowth of primary rat brain neurons in a dose-dependent manner.

圖4 α-Syn向細胞內的轉運Fig.4 Transportation of α-Syn into primarily cultured neurons

3 討論

在原代培養的神經細胞生長初期，微管(microtubule)在神經細胞的軸突和樹突中起支撐作用，幫助突起生長。在成熟的神經元中，微管是物質運輸的途徑，參與神經遞質的傳遞。體外研究［6，13-14］證明，α-Syn具有與tau蛋白相似的作用，可以促進微管蛋白組裝成微管。我們研究發現通過促進微管的組裝，α-Syn可以促進大鼠原代神經元突起的生長，這一作用提示該蛋白很可能參與神經系統早期發育階段神經元突起的形成以及中樞神經系統損傷后的修復［9，15-16］。而突變體 A53T和 A30P則失去這種有序的微管組裝功能，在家族PD患者的腦神經元受到某種致病因子損傷后，由于伴侶蛋白的突變，影響微管的合成和有序排列，致使神經元突起修復和重建障礙或軸漿轉運紊亂，導致細胞間或細胞內無定形物的形成聚集。促微管聚合的作用的喪失，可能影響神經系統的早期發育以及中樞神經系統損傷后的修復，對揭示α-Syn突變導致神經元退變的機制也有重要意義。因此我們以原代培養神經元為觀察對象，研究α-Syn突變體對神經元突起生長的影響。

實驗結果顯示，在原代神經元培養4 h內，α-Syn可促進突起生長，A53T和A30P對突起生長無影響。Sung J Y等［17］實驗發現α-Syn抑制H19-7大鼠海馬神經祖細胞的增生。我們的實驗結果顯示，α-Syn對神經元生長的影響僅限于突起的生長，對神經元胞體的大小、形態沒有影響。Western blotting結果顯示添加α-Syn組細胞內蛋白免疫反應呈陽性，A53T組、A30P組和對照組同為陰性。免疫熒光印跡結果顯示，α-Syn在神經元的胞體和突起呈現輪廓清晰的綠色熒光，這說明外源性的α-Syn在胞體和突起均有分布，分布廣泛、均勻。這與微管在細胞內的分布一致，提示進入細胞的α-Syn與微管蛋白之間存在伴侶關系。α-Syn分子含有7個KTKEGV不完全重復序列，該序列能夠介導α-Syn過細胞膜［18-19］。其N端1～60氨基酸，就含有4個重復的KTKEGV殘基，而30和53位的錯義突變導致α-Syn的構象改變不能進入神經元，失去與微管蛋白結合促突起生長的能力。目前，α-Syn與微管蛋白之間的共同作用關系正成為解釋PD病因的新的研究熱點。此研究結果為揭示α-Syn的功能，及其與微管蛋白的關系提供了新證據，對突變型α-Syn導致PD的病因、病理機制闡述提供了新思路。

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