間歇性低氧動(dòng)物模型的建立及驗(yàn)證

李秀翠 蔡曉紅 溫正旺 梁冬施 曹順順 胡青青 潘國權(quán) 陳尚勤

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)指上呼吸道反復(fù)塌陷堵塞引起的呼吸暫停和通氣不足，主要表現(xiàn)為打鼾，伴呼吸暫停、夜間反復(fù)低氧血癥、高碳酸血癥、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂以及白天嗜睡，兒童OSAHS發(fā)病率達(dá)1%～3%，老年人的發(fā)病率更高。研究表明OSAHS與冠心病、高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切，越來越受到人們的重視［1～4］。間歇性低氧是其特征性的病理機(jī)制，IH模型普遍用于研究OSAHS的低氧機(jī)制，但I(xiàn)H模型是否有效地模擬OSAHS前人尚未充分驗(yàn)證，因此本實(shí)驗(yàn)建立并驗(yàn)證IH模型，以確保模型的有效性。

材料與方法

1.材料:SPF級(jí)雄性SD幼鼠20只，體重100±10g，溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK(浙)2005－0061］提供;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)復(fù)合模擬艙及對照艙由本實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合濰坊華信氧業(yè)有限公司研制;其他主要儀器和材料:血?dú)夥治鰞x(GEM Premier 3000)、醫(yī)用氧氣和高純度氮?dú)?濃度＞99.99%，本市醫(yī)用氧氣廠)、水銀體溫計(jì)、秒表。

2.氧艙的制備:氧艙的建立參照 Nair等［5］和 Wang 等［6］等的方法加以改進(jìn)。氧艙的主體設(shè)備主要由以下部分組成:①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)復(fù)合模擬艙:60cm×22cm×16cm;②動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對照艙;③氮?dú)夤艿?④氧氣管道;⑤空氣管道;⑥空氣壓縮機(jī);⑦氣體流量控制閥;⑧PLC及電腦控制系統(tǒng)。氧艙側(cè)壁上各有4個(gè)進(jìn)氣、排氣單向閥，不同氣源有不同的通氣管道，均由程序控制電磁閥開關(guān)，艙內(nèi)壓力始終保持常壓。通過自行設(shè)定實(shí)驗(yàn)參數(shù)及各種氣體的流量值并輸入電腦控制程序，調(diào)控艙內(nèi)氧氣濃度，模擬不同的IH環(huán)境，氣體流入狀態(tài)可通過控制程序經(jīng)顯示器讀出，艙內(nèi)氧濃度由艙內(nèi)氧氣檢測儀讀出。氧艙置于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，所有儀器設(shè)備嚴(yán)格消毒后置入。氧艙示意圖及艙體實(shí)物圖見圖1、圖2。

3.模型建立:將20只SD幼鼠隨機(jī)分為4組:90s 10%模型組(A)，60s 10%(B)模型組和60s 5%模型組(C)，空氣對照組(D)，每組各5只。設(shè)置IH氧艙參數(shù):低氧時(shí)間、常氧時(shí)間、每次循環(huán)時(shí)間、最低氧濃度上限、最低氧濃度下限、最高氧濃度上限、最高氧濃度下限，模型組參數(shù) A組:45s、45s、90s、13.05%、10.80%、20.50%、19.00%;B 組:30s、30s、60s、13.15%、10.90%、20.55%、19.25%;C 組:30s、30s、60s、7.90% 、5.55% 、20.65% 、19.25% 。實(shí)驗(yàn)期間按照預(yù)設(shè)的參數(shù)向動(dòng)物實(shí)驗(yàn)復(fù)合模擬艙內(nèi)輸送氮?dú)夂脱鯕猓ㄟ^監(jiān)測氧艙內(nèi)的氧濃度及低氧時(shí)間來控制氮?dú)夂脱鯕獾倪M(jìn)氣，保證最低氧濃度和最高氧濃度分別在如下范圍內(nèi)變化:A組和B組:10.0% ±1.5%、21.0% ±0.5%，C組:5.0% ±0.5%、21.0% ±0.5%。空氣對照組置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對照艙內(nèi)，向?qū)φ张搩?nèi)輸送空氣，保證艙內(nèi)溫度和室內(nèi)溫度22～24℃，濕度40%～50%。氧艙內(nèi)氧濃度隨時(shí)間的變化可通過電腦界面顯示，見圖3。

圖3 氧艙電腦界面

4.動(dòng)物處理:給予大鼠3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)上，分離頸總動(dòng)脈，將注入肝素的留置針尾端連肝素帽，留置針插入頸總動(dòng)脈，中間連接處用線扎好，縫合固定。待大鼠清醒時(shí)，測量呼吸、體溫，然后依次將其置于上述建立的氧艙模型中，2h末測量大鼠體溫、呼吸，模型組于電腦界面上正弦波達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)開始抽血，D組任意時(shí)間點(diǎn)抽血，一個(gè)低氧－復(fù)氧周期抽血5次，同一實(shí)驗(yàn)組間隔相同的時(shí)間(A、D 組均間隔22.5s，B、C組間隔15s)，每次抽血時(shí)間＜3s，抽取0.5ml動(dòng)脈血，迅速行血?dú)夥治觯涗浹獨(dú)饨Y(jié)果，5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 PO2、SaO2分別表示為 P1、P2、P3、P4、P5，S1、S2、S3、S4、S5。動(dòng)脈插管前、插管后及抽取動(dòng)脈血的操作分別如圖4a、b、c。

圖4 動(dòng)脈插管及動(dòng)脈取血操作

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，各時(shí)間點(diǎn)之間的組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠體溫和呼吸次數(shù)的比較:與D組比較，A、B、C模型組造模后呼吸明顯加快，A、B、C組內(nèi)比較，造模后呼吸較造模前明顯加快(P＜0.05)，D組造模后呼吸與造模前比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);各組間及組內(nèi)體溫?zé)o差異(P＞0.05)(表1)。

表1 4組大鼠體溫和呼吸次數(shù)比較

2.4組大鼠 PO2及 SaO2比較:A、B、C 模型組組內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PO2及SaO2比較:F分別為67.92、300.89，449.38、108.69，2037、931.18，P 均 ＜ 0.05，有明顯差異;與其余4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PO2、SaO2比較，P3及 S3下降(P ＜0.05)，1和5，2和4時(shí)間點(diǎn)的 PO2及SaO2比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。D組組內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 PO2及 SaO2比較，F(xiàn) 分別為 1.61、2.15，P均＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4組 PO2及 SaO2變化見圖5。

3.4組P3及S3組間比較:與D組比較，模型組P3及S3降低(P＜0.05);與 A組比較，B組 P3及 S3升高(P ＜0.05)，C 組 P3及 S3降低(P ＜0.05);C 組 P3及S3較B組降低(P＜0.05)(表2)。

討 論

圖5 4組組內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PO2及SaO2比較

表2 4組P3及S3組間比較

OSAHS特征性的低氧方式是慢性間歇性低氧，此低氧－復(fù)氧方式出現(xiàn)類似于缺血/再灌注過程中的病理變化，自從1992年Fletcher首次報(bào)道了慢性間歇低氧－復(fù)氧大鼠模型以來，陸續(xù)有報(bào)道間歇低氧－復(fù)氧睡眠呼吸暫停綜合征的動(dòng)物模型［7～9］，建立模型的實(shí)驗(yàn)裝置有不同類型:①往復(fù)運(yùn)動(dòng)式低氧艙，是低氧艙在動(dòng)物艙之間往復(fù)運(yùn)動(dòng)，使動(dòng)物艙間歇進(jìn)入低氧環(huán)境，可基本模擬反復(fù)缺氧－復(fù)氧的病理生理特征，但對設(shè)備要求高，操作復(fù)雜;②低壓低氧艙，通過改變氧艙升降速率模擬不同的海拔高度，產(chǎn)生不同的壓力和氧濃度，從而達(dá)到低氧－復(fù)氧的效果，對設(shè)備的要求較高，不能準(zhǔn)確反映常壓下缺氧的情況;③低O2高CO2箱，采用單片機(jī)技術(shù)和反饋原理，自動(dòng)調(diào)節(jié)氧艙內(nèi)O2、CO2濃度，建立低氧和CO2潴留模型，不能排除CO2在低氧－復(fù)氧機(jī)制研究中的干擾作用。本研究制備常壓間歇性低氧氧艙來模擬睡眠呼吸暫停綜合征，符合低氧、間歇性等特點(diǎn)，氣源采用常用的醫(yī)用氧和醫(yī)用氮，而非混合氣體，來源簡便易得;艙內(nèi)氧濃度、氣體輸送、低氧－復(fù)氧循環(huán)時(shí)間等均采用自動(dòng)控制、自動(dòng)監(jiān)測，保證了實(shí)驗(yàn)條件的精確性和可靠性;采用氮?dú)馀c氧氣交替輸送的方式，克服了前期一些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械獨(dú)?或低氧混合氣)與空氣交替輸送方式帶來的大容積艙氧濃度不易快速升高的不足;本實(shí)驗(yàn)氧艙模型可由實(shí)驗(yàn)者設(shè)定多項(xiàng)參數(shù)，研制不同低氧濃度和時(shí)間的IH模型、低氧高二氧化碳等多種氧艙模型，具備良好的人性化(圖3)。

本實(shí)驗(yàn)IH氧艙模型的建立操作簡便、控制精確、具備人性化，但I(xiàn)H模型是否能有效地模擬OSAHS尚需充分驗(yàn)證，許多學(xué)者將以下多種驗(yàn)證方法結(jié)合起來，如活動(dòng)減少，睡眠增多，呼吸頻率加快伴有鼾聲等，本實(shí)驗(yàn)也表明缺氧時(shí)大鼠呼吸明顯加快，但該標(biāo)準(zhǔn)帶有主觀性，只能作為大致的參考;多導(dǎo)睡眠監(jiān)測對判斷該模型與人類OSAHS的相符程度具有重要的參考價(jià)值，但可靠性不佳;模型動(dòng)物的上呼吸道改變對于評價(jià)OSAHS模型也十分重要，但可操作性差，而動(dòng)脈血?dú)夥治鍪窃u定IH模型動(dòng)物與OSAHS病人低氧的重要依據(jù)，因此本實(shí)驗(yàn)通過血?dú)夥治鲈u價(jià)IH氧艙模型中大鼠產(chǎn)生的低氧影響，驗(yàn)證模型的有效性及合理性［10］。

IH模型的低氧－復(fù)氧循環(huán)時(shí)間多為12～90s，最低氧濃度多為 5% ～10%［11～14］。本實(shí)驗(yàn)選取 90s 10%、60s 10%、60s 5%3個(gè)模型，血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示:一個(gè)低氧－復(fù)氧周期內(nèi)，模型組的PO2及SaO2有明顯的波動(dòng)，表明大鼠體內(nèi)處于低氧－復(fù)氧狀態(tài)，與IH氧艙內(nèi)氧濃度的變化一致，驗(yàn)證了模型的有效性;OSAHS可對心血管、內(nèi)分泌、血液、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)器官產(chǎn)生影響。本課題組前期已利用間歇性低氧大鼠模型成功模擬OSAHS對肺循環(huán)和右室功能的影響，神經(jīng)系統(tǒng)海馬、額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，空間學(xué)習(xí)記憶損害等OSAHS對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了此模型的有效性。本研究組間比較結(jié)果提示不同的IH模型產(chǎn)生不同程度的低氧改變，同時(shí)表明低氧的程度與IH循環(huán)周期、低氧時(shí)間和最低氧濃度有關(guān)，從而本實(shí)驗(yàn)可以通過調(diào)整上述因素建立不同的IH模型，這與羅玲等的觀點(diǎn)是一致的。本實(shí)驗(yàn)IH模型中最低氧飽和度分別為(75±3)%、(89±1)%、(52±4)%，通過血?dú)夥治鼋Y(jié)果中最低氧飽和度評價(jià)低氧的程度，根據(jù)阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(草案)判斷模型的分度，得出90s 10%模型可以反映輕度OSAHS，90s 10%模型模擬中重度OSAHS，60s 5%模型可以較好地反映重度OSAHS的病理變化，證明本IH模型可以有效地模擬OSAHS。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)IH氧艙模型的建立操作簡便、控制精確、重復(fù)性佳，可模擬不同病情輕重的OSAHS，模型符合疾病的病理生理特點(diǎn)，是目前研究OSAHS低氧機(jī)制的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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