大豆乳清中淀粉酶的超濾提取技術研究

陳超琴，趙黎明，蔣麗華，夏泉鳴

(華東理工大學發酵工業分離提取技術研發中心，華東理工大學食品科學與工程系，上海200237)

在大豆分離蛋白生產過程中會產生大量乳清廢水，每生產1t大豆分離蛋白，約排放出60～80m3的乳清廢水，大豆乳清廢水的BOD高達5000～8000mg/L，超出國家規定的廢水排放標準的100多倍［1］。目前國內大豆分離蛋白產能約60萬t，大豆乳清廢水的處理已經成為制約大豆深加工產業健康發展的瓶頸。對大豆乳清廢水的傳統處理方法是直接進行厭氧和好氧生物處理以降低廢水中的COD及BOD值，利用微生物來降解廢水中的有機物質，這樣處理后即使能達到國家廢水排放標準，但因為處理成本極高企業承受不起，同時廢水中的大量的有用物質也白白浪費［2］。目前國內也有企業通過將大豆乳清廢水進行沼氣發電進行綜合處理利用，但無論是處理效果還是處理成本，都不能讓企業滿意。乳清廢水中含有豐富的乳清蛋白、低聚糖等有用物質。其中乳清蛋白主要含有Kunitz胰蛋白酶抑制劑、β-淀粉酶和凝集素，其次是Bownma-Birk胰蛋白酶抑制劑、脂肪氧化酶等［3］。近年來，很多學者致力于開發各種先進技術如膜分離技術、樹脂層析、色譜、超臨界流體萃取、高效液相色譜等技術來提取大豆乳清廢水中的有用物質如大豆乳清蛋白、大豆低聚糖、大豆異黃酮等，并取得了較好的成果，但是從大豆乳清廢水中提取 β-淀粉酶國內報道較少。β-淀粉酶在制備結晶麥芽糖及麥芽糖醇、飴糖、啤酒、飲料、面包、醬油、白酒等工業生產過程具有重要的作用。本文重點探討了超濾技術提取大豆乳清中β-淀粉酶的應用效果和工藝參數，為大豆乳清資源化利用提供一些新的思路和方法。

表1 大豆乳清主要成分分析Table 1 Analysis of soybean whey wastewater

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大豆乳清廢水 山東萬得福實業集團有限公司提供;3，5-二硝基水楊酸(DNS)、酒石酸鉀鈉、可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、SDS(十二烷基磺酸鈉)、Acr(丙烯酰胺)、Bis(N，N＇-亞甲基雙丙烯酰胺)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、甘氨酸、Aps(過硫酸氨)溴酚藍、甘油、冰醋酸、乙醇、b-2-巰基乙醇、考馬斯亮藍R250、甲醇、乙醇 均為分析純，上海凌峰化學試劑有限公司;TEMED(四甲基乙二胺)、蛋白分子量標準(97.4、66.2、43，31、20.1、14.4ku)上海捷瑞生物工程有限公司。

QY-NUF-1812膜設備、QY-UF-3-T-1812及QY-UF-10-T-1812超濾膜(聚醚砜，有效膜面積:0.24m2)上海齊豫生物科技有限公司;Amicon Ultra-153，10ku MWCO超濾離心管 美國 Millipore公司;5810R離心機 Eppendorf;UV-2000紫外可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;KDN-2C型凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;FE20精密pH計 梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;HHS-21-4孔型電熱恒溫水浴鍋 上海醫療機械五廠;SE1501F電子天平(0.1g)奧豪斯儀器(上海)有限公司;電泳儀、垂直電泳槽 Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-淀粉酶活力測定［4］采用Bernfeld方法測定酶活。酶活定義:25℃、pH4.8下每分鐘釋放出1μmol麥芽糖所需的酶量為1U。

1.2.2 蛋白質含量測定 采用凱氏定氮法檢測乳清中粗蛋白含量［5］。

1.2.3 大豆乳清中蛋白質分子量分布 采用SDSPAGE分析乳清中蛋白質分子量分布。

1.2.4 總糖含量測定 采用蒽酮比色法［6］。

1.2.5 總固形物含量測定［7］準確稱取液體樣品，在105℃烘箱中經過24h烘干后置于干燥器中恒重12h，測定烘干后固體的質量。

1.2.6 灰分檢測指標 采用GB48-84進行灰分檢測［8］。

1.2.7 跨膜壓差、膜通量及截留率的測定 在料液罐中加入純水或料液，全循環操作模式操作，設定溫度和跨膜壓差，待設備壓力表指示穩定后，記錄膜進口和出口的壓力，并按照式(1)計算跨膜壓差［9］:

式中:Pin為膜進口壓力，bar;Pout為膜出口壓力，bar;ΔP 為跨膜壓差，bar。

使用量筒和秒表測定一定時間內透過液的體積，并按式(2)計算膜通量:

式中:Jv為膜通量，L/(m2·h);Vp為透過液體積，L;tf為過濾時間，h;Am為有效膜面積，m2。

定時在濃縮側和透過側取樣，檢測其中β-淀粉酶的活力，并按式(3)計算截留率:

式中:Robs為表觀截留率，%;Cp為透過液溶質濃度，U/mL;Cb為料液主體相濃度，U/mL。

1.2.8 大豆乳清的濃縮實驗 大豆乳清表面有大量的泡沫，廢水呈渾濁狀態，并有少量廢渣沉淀，因此料液在進超濾膜前必須進行預處理。將乳清廢水的pH調節在4.5～9，靜置2h后進行離心，去除沉淀廢渣。得到的上清液用于超濾過程的原料液。將經過預處理的大豆乳清加入料液罐中，進料體積為12L，在經過優化的操作條件下進行過濾濃縮，濃縮倍數約為10倍，每隔10min，測定膜通量，并在每個濃縮倍數下在膜兩側同時取樣，進行成分分析。

2 結果與討論

2.1 豆乳清主要成分分析

大豆乳清的主要成分如表1所示。

大豆乳清中蛋白分子量分布如圖1所示。從圖中可以看出，大豆乳清中蛋白質的分子量主要分布在20～97ku，根據文獻報道［10］，譜帶 A 的分子量在92500附近，代表脂肪氧合酶;譜帶 B的分子量在55000左右，由于7S中的 β亞基分子量為52000，β-淀粉酶的分子量是57000，所以，譜帶B可能包括了這兩個成分;譜帶C的分子量在20000左右，11S蛋白中B亞基的分子量為20000，而KT胰蛋白酶抑制劑的分子量為21500，所以譜帶C中包括這兩個成分，因為乳清中11S的含量少，譜帶C可以認為主要是KT胰蛋白酶抑制劑。Sorgentini等［3］曾報道在乳清中溶解著大約占總蛋白10%左右的2S和7S成分，2S的主要成分是胰蛋白酶抑制劑，7S中含有脂肪氧合酶和β-淀粉酶。

圖1 SDS-PAGE分析大豆乳清蛋白質分子量分布Fig.1 SDS-PAGE analyses the protein molecular weight distribution of soybean whey wastewater

對大豆乳清進行SDS-PAGE分析是為了選擇合適截留分子量的膜，為了保證β-淀粉酶的回收率在90%以上以及避免胰蛋白酶抑制劑對膜造成的堵塞污染，選擇3ku和10ku的MWCO超濾膜進行實驗，從而進一步確定合適的膜。

2.2 料液pH對超濾的影響

大豆乳清表面有大量的泡沫，廢水呈渾濁狀態，并有少量廢渣沉淀，因此料液在進超濾膜前必須進行預處理。將乳清廢水的pH調節在4.5～9，靜置2h后進行離心，去除沉淀廢渣。得到的上清液中β-淀粉酶的酶活回收率如圖2所示。從圖2可以看出，經過預處理的上清液酶活的回收率均在95%以上。在實驗過程中，從肉眼觀察中可以看到的現象是，隨著pH的增加，上清液的透明度逐漸升高，在pH7以上，溶液透明度明顯好于pH小于7的情況，這是由于pH高于7時，乳清中大部分蛋白溶解度好。

圖2 乳清廢水預處理Fig.2 Pretreatment of the soybean whey wastewater

為了考察在超濾過程中，料液不同pH對酶活回收率的影響，將上述得到的不同pH的上清液通過超濾離心管進行實驗，超濾離心的條件為:MWCO 3ku;溫度4℃;轉速3050×g;上樣量15mL;時間20min。離心結束后，分別收集濃縮液和透過液樣品，對樣品進行酶活力的檢測，計算酶活的回收率。如圖3所示，pH4.5～5.5區間為大多數蛋白質的等電點區間，因此隨著濃縮的進行，料液逐漸變渾濁，有些蛋白吸附在膜表面，造成回收率的下降;pH6～7為酶活回收率較高的區間，pH7.0為酶活回收的最高點(95%);在濃縮過程中料液一直呈澄清狀態，但pH7.5～9.0時由于料液處于堿性環境下，β-淀粉酶的穩定性有所下降，造成回收率的下降。因此，在離心超濾實驗中，確定料液的pH為6～7。

圖3 不同pH料液對超濾過程酶活回收率的影響Fig.3 Effect of feed pH on the enzyme recovery during the UF process

為了進一步確定超濾過程料液的pH，在實驗膜設備中，選用MWCO 3ku聚醚砜材質的超濾膜，在全循環操作模式下，比較了pH5.0、6.0、7.0下膜通量的大小。從圖4可知，在相同的跨膜壓差下，pH7.0料液的膜通量顯著高于pH6.0和pH5.0下的膜通量，pH5.0下膜通量最低。因此，本實驗選擇pH7.0的料液作為超濾過程的初始料液。

圖4 不同料液pH對膜通量的影響Fig.4 Effect of feed pH on the permeate flux

2.3 操作溫度對超濾的影響

將pH7.0的上清液在超濾離心管中進行實驗，超濾離心的條件為:MWCO:3ku;轉速:3050×g;上樣量:15mL;時間:20min。離心結束后，分別收集濃縮液和透過液樣品，對樣品進行酶活力測定并計算酶活回收率。有機超濾膜的耐受溫度不高于45℃，因此，本實驗中對溫度的設定范圍為4～36℃。從圖5可看出，隨著溫度的上升，酶活的膜回收率下降的趨勢較小，基本維持在90%左右。在較低的操作溫度下，酶活的膜回收率較高，但能耗較高，而且低溫下，料液粘度較大，膜通量較小。綜合考慮酶活回收率以及運行效果，選擇(25±3)℃作為超濾過程的操作溫度。

圖5 超濾過程操作溫度對酶活回收率的影響Fig.5 Effect of operating temperature on the enzyme recovery during the UF process

2.4 跨膜壓差對初始膜通量的影響

如圖6所示，在(25±3)℃下，3ku膜的純水膜通量，隨跨膜壓差TMP的增加幾乎呈線性增加。而如圖4所示，在pH7.0料液中，3ku膜的膜通量隨著跨膜壓差的增加而增加，在跨膜壓差達到2bar以上時，膜通量上升緩慢，基本達到一個平穩的狀態，這一現象可由兩點解釋:一方面，由于膜通量的增大，使得濃差極化效應增加，膜面濾餅層被壓縮且積累速率增大，膜污染阻力增大;另一方面，由于設備的泵額定功率是一定的，當跨膜壓差增大時，靜壓能不斷增大，因此動能逐漸減小，即膜面流速減小，濃差極化效應增加［11］。跨膜壓差小于2bar時，為壓差控制區，跨膜壓差大于2bar時，則為濃差極化阻力控制區。因此，選擇跨膜壓差為2bar作為超濾濃縮過程的操作壓差。

圖6 跨膜壓差對純水膜通量的影響Fig.6 Effect of TMP on the permeate flux of distilled water

2.5 膜截留分子量的選擇

本實驗研究了MWCO 3ku和10ku的膜對乳清進行超濾的效果。超濾條件:跨膜壓差:2bar(3ku)，2.5bar(10ku)，操作溫度:(25±3)℃;料液 pH7.0。如圖7所示，隨著濃縮倍數的增加，兩支膜的截留率均呈上升趨勢，但是，10ku膜對β-淀粉酶的截留率明顯低于3ku膜，在同一濃縮倍數下，兩者的差距在10%以上。因此，從酶活的回收率出發考慮，優先選擇3ku膜。同時可以從圖8中看出，3ku膜的膜通量隨著濃縮倍數的增加逐步衰減，在濃縮倍數達到10倍時，膜通量為23L/m2·h，濃縮過程平均膜通量為35L/m2·h。因此，本實驗選擇3ku膜進行濃縮。

圖7 濃縮倍數對β-淀粉酶截留率的影響Fig.7 Effect of volumetric concentration ratio on the enzyme rejection

圖8 濃縮倍數對3ku膜通量的影響Fig.8 Effect of 3ku volumetric concentration ratio on the permeate flux

2.6 驗證實驗

將經過預處理的乳清廢水，其中β-淀粉酶的活力為11U/mL，使用MWCO 3ku的膜進行濃縮，操作條件為:料液 pH7;跨膜壓差 2bar;操作溫度(25±3)℃，進料體積為12L。在料液濃縮倍數為10倍時停止操作，此時的膜通量由初始的44L/(m2·h)衰減至23L/(m2·h)，平均通量達到35L/(m2·h);β-淀粉酶的酶活力可達到101U/mL，酶活濃縮倍數約為9倍，總酶活的回收率為92%。

3 結論

通過對超濾過程料液pH、操作溫度、跨膜壓差、膜截留分子量等參數的探討，得出用超濾技術對大豆乳清中β-淀粉酶進行的濃縮的最佳條件為:料液pH為7，操作溫度(25±3)℃，跨膜壓差2bar;截留分子量MWCO 3ku的膜。得到的濃縮液中，β-淀粉酶的活力為101U/mL，濃縮倍數為10。得到的濃縮液為下一階段對β-淀粉酶進行分離純化提供了良好的料液基礎。

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