采用響應曲面法優化紅曲霉發酵培養基組分

周建建，蘇 理，，趙雙枝 ，張彥昊，郭宏明

(1.山東輕工業學院食品與生物工程學院，山東濟南250353;2.山東省食品發酵工程重點實驗室，山東濟南250013;3.泰興市一鳴生物制品有限公司，江蘇泰興225433)

紅曲在我國的生產和應用源遠流長，已經有上千年的歷史，而采用現代科學方法研究紅曲卻始于1884年法國生物學者Van Tidghen從馬鈴薯培養基上分離純化得到兩種紅曲霉菌株開始，印尼學者Went 1895年對紫紅曲菌種進行了菌種鑒定［1］。紅曲紅色素是紅曲霉次級代謝產物色素的一種，是目前唯一一種利用微生物發酵制備的天然藥食兩用色素。紅曲紅色素符合食品著色劑“營養、天然、多功能“的發展要求和方向，因此值得大力應用和推廣［2］。隨著科學技術的高速發展，人工合成色素的弊端日益顯露，加之人類生活水平的提高和醫學水平的進步，人們越來越傾向于使用天然化的食品及化妝品，可見天然色素的用量將會繼續增加。如何提高液態深層發酵法紅曲紅色素的產量及質量是當前科研工作者面臨的一個重大難題。本研究旨在優化紅曲霉1001的發酵培養基配方，以期為工業化大規模生產提高參考，以推廣我國的紅曲產業，因此本論文的研究具有積極深遠的意義［3］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲霉1001 山東省食品發酵工業研究設計院實驗室保藏;乳酸 天津市永大化學試劑開發中心;瓊脂 北京奧博星生物科技有限責任公司;豆粉 石家莊泰富豆餅粉廠;蔗糖 廣東光華化學廠有限公司;KH2PO4山東荊河日用化工有限公司;NaNO3廊坊鵬彩精細化工有限公司;MgSO4萊州市萊玉化工有限公司;麥芽糖、可溶性淀粉 天津市科密歐化學試劑有限公司;酵母膏、蛋白胨(BR) 北京奧博星生物科技有限責任公司;葡萄糖(食品級) 山東西王集團;大米粉 長沙米粉公司;玉米漿 魯洲生物技術(山東);斜面培養基(g/L) 麥芽糖40.00，可溶性淀粉40.00，蛋白胨 35.00，瓊脂 20.00，pH 自然，0.1MPa 滅菌20min;基本種子培養基(g/L) 大米粉40.00，豆粉2.32，NaNO38.36，KH2PO42.50，MgSO41.00，乳酸調 pH至3.8～4.2，0.1MPa滅菌20min;基本發酵培養基(g/L)大米粉 85.00，KH2PO42.00，NaNO30.05，MgSO41.00，pH5.5～6.0，0.1MPa 滅菌20min。

表1 Plackett－Burman實驗設計Table 1 Plackett－Burman experimental design

獨軸旋轉式搖瓶機 無錫市錫山制鎖設備廠;JA 12002電子天平、雷磁PHS－3C PH計 上海精科精密科學儀器有限公司設備廠;752型紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;電熱恒溫培養箱山東濰坊精鷹醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 斜面培養:33℃，培養10～15d;種子培養:500mL 三角瓶，裝液量70mL，33℃，200r/min，培養24h;搖瓶發酵:500mL三角瓶，裝液量70mL，接種量 6%，33℃，180r/min，培養 120h。

1.2.2 黃豆粉水解液的制備方法 10%黃豆粉堿性水解液的制備:稱取所需的黃豆粉，加水定容并用NaOH調pH至9.0～9.5，于0.1MPa下處理30min，配料時用鹽酸調至中性，然后直接加到原料中即可。黃豆粉酸性水解液的制備:稱取所需的黃豆粉，按照固液比3∶1加入1mol/L的鹽酸，于0.1MPa下處理30min，配料時用氫氧化鈉調至中性，然后直接加到原料中即可。

1.2.3 紅曲紅色素的測定方法 按照中國國家標準局2005年頒布的《中華人民共和國國家標準食品添加劑紅曲紅》(GB15961－2005)測定［4］。

1.2.4 發酵培養基配方的優化 不同碳源、氮源、無機鹽及生長因子的篩選，均采用單因素實驗。

1.2.4.1 不同碳源對色素產量的影響研究 紅曲霉發酵生產紅曲紅色素主要以大米粉為基本介質，因此在研究碳源對紅曲紅色素產量的影響時，保留了大米粉，另外增加了其它類型的碳源。添加其他碳源的目的在于使紅曲霉發酵前期能夠快速增殖，從而縮短發酵周期。為了確定紅曲霉1001產紅曲紅色素的最佳碳源，分別選取60g/L的葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、紅薯淀粉、麥芽糖及甘油作為發酵培養基中的碳源，其他成分均采用基本發酵培養基的配方。

1.2.4.2 不同氮源對色素產量的影響研究 氮源主要用于構成菌體細胞物質(氨基酸、蛋白質和核酸等)和含氮代謝物，因此是菌體生長代謝所必需的。常用的氮源可分為兩大類:有機氮源和無機氮源。

為了得到紅曲霉1001發酵培養基的最佳氮源，分別選用0.50g/L的無機氮源氯化銨、硝酸銨、谷氨酸鈉、硝酸鈉、硫酸氨和10.00g/L的有機氮源酵母粉、牛肉膏、黃豆粉、黃豆粉酸、堿性水解液、酵母膏、蛋白胨等為氮源，以發酵液中紅曲紅色素的色價為主要指標，考察氮源種類對紅曲霉1001發酵的影響。

1.2.4.3 不同無機鹽對色素產量的影響研究 無機鹽在微生物的生長代謝過程中是一類不可缺少的微量物質，能夠維持微生物的正常生理活動。微生物的合成需要多種無機鹽，這些無機鹽離子作為底物降解的輔助因子，作為酶的組成成分或維持酶的活性，或構成菌體原生質體的成分(磷、硫等)。K+和Mg2+就是這方面兩個最常見的因素。加入的有關化學試劑中，首選的是KH2PO4和MgSO4，因為它們可以提供四種需要量最大的元素。選取不同濃度的KH2PO4、MgSO4考察紅曲霉1001對無機鹽的利用情況。此外，還添加了FeSO4、ZnSO4及其組合考察紅曲霉1001對Fe2+、Zn2+的利用情況。

1.2.4.4 生長因子對色素產量的影響研究 生長因子是微生物生長必需的物質，雖然需要量不大，但卻是必需的，它的作用就是讓微生物能正常生長。選取玉米漿考察生長因子對紅曲霉1001發酵生產的影響。

1.2.4.5 響應面實驗 根據單因素實驗的結果，運用Plackett－Burman設計法，最陡爬坡實驗以及Box－Benhnken Design設計法進行培養基的優化。Plackett－Burman實驗設計見表1。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對色素產量的影響

碳源是發酵培養基中最重要的成分之一，為菌體的生長繁殖提供能源和合成菌體所必需的成分。由圖1可知，不同碳源對于紅曲霉1001產色素影響很大，以葡萄糖為碳源時發酵液色價最高可達190U/mL，明顯優于其它碳源，故選定葡萄糖為最佳碳源。

圖1 不同碳源對色素產量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on pigments content

2.2 不同氮源對色素產量的影響

在培養基中合理地加入不同氮源，有利于縮短紅曲霉生長時間，提高色素的產量。實驗結果見圖2。由圖2可知，有機氮源發酵產紅曲紅色素的色價普遍高于無機氮源發酵產紅曲紅色素的色價，并且在無機氮源中硝酸鈉發酵產紅曲紅色素的色價是最高的，在有機氮源中蛋白胨發酵產紅曲色素的色價是最高的，黃豆粉次之。但從經濟角度出發，黃豆粉更適合作有機氮源。

圖2 不同氮源對色素產量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on pigments content

為了確定有機氮源和無機氮源之間的相互協調作用，選取色價相對較高的有機氮源黃豆粉和蛋白胨以及無機氮源硝酸鈉進行相互組合。實驗結果如圖3，由此可見黃豆粉與硝酸鈉的組合要好于蛋白胨與硝酸鈉的組合，因此選取黃豆粉與硝酸鈉為最佳氮源。

圖3 有機氮源和無機氮源組合對色素產量的影響Fig.3 Effect of combination of organic nitrogen and inorganic nitrogen sources on pigments content

2.3 無機鹽對色素產量的影響研究

2.3.1 KH2PO4對色素產量的影響研究 不同濃度的KH2PO4對紅曲色素的影響如圖4所示，隨著KH2PO4濃度的增加，紅曲色素的色價在增加，當KH2PO4的濃度在2.00g/L時，紅曲色素的色價最高，達到221.00U/mL，但如果KH2PO4的濃度繼續增加，則紅曲色素的色價會降低。磷酸鹽濃度可以顯著的影響菌體細胞的生長和紅曲色素的形成。

圖4 不同濃度KH2PO4對色素產量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of KH2PO4on pigments content

2.3.2 MgSO4對色素產量的影響 文獻報道，添加適量的MgSO4對細胞的生長和產物的形成都有影響，由圖5可以看出，添加1.00g/L的MgSO4與不添加者相比，紅曲紅色素的產量提高近77%，達到235.00U/mL。Mg2+對紅曲紅色素的生成有明顯的促進作用，最佳濃度1.00g/L。鎂離子濃度超過0.15%時又會對色素的產生有不利的影響。因此選擇1.00g/L的MgSO4作為發酵培養基的基本成分。

圖5 不同濃度MgSO4對色素產量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of MgSO4on pigments content

2.3.3 FeSO4、ZnSO4及其組合的影響 據文獻報道［5］，Fe2+、Zn2+對紅曲霉的生長代謝均有影響。根據 MgSO4的研究結果，宜選取 FeSO4、ZnSO4為1.00g/L，1.00g/L FeSO4+1.00g/L ZnSO4為組合，結果見圖6。從圖6中可以看出，含ZnSO4的組分要高于對照組，FeSO4+ZnSO4低于對照組，而含FeSO4的組分要遠遠低于對照組，這說明Zn2+能夠促進紅色素的合成，而Fe2+卻能夠抑制紅色素的合成。因此，培養基中應添加適量的Zn2+。

圖6 FeSO4、ZnSO4及其組合對色素產量的影響Fig.6 Effect of FeSO4、ZnSO4 and combination of them on pigments content

2.4 玉米漿對色素產量的影響研究

玉米漿除了作為紅曲霉發酵的氮源外，還因其含有大量的微量元素，對微生物發酵有促進作用。由圖7可以看出，當玉米漿濃度大于3.50g/L，紅曲紅色素的色價基本不變，在培養基中加入3.50g/L的玉米漿，紅曲紅色素的色價明顯提高，由235.00U/mL上升為285.00U/mL。

2.5 Plackett－Burman 實驗

根據單因素實驗選取對紅曲紅色素有影響的8個因素，每個因素選高低2個水平，以發酵液紅曲紅色素的色價作為響應值。另外選擇3個虛擬項，以考察實驗誤差，共11個因素，每組實驗重復3次，取3次的實驗平均值。選取N=11的Plackett-Burman設計對發酵培養基中的8個組分的重要性進行考察，實驗設計及結果見表2。運用Design Expert7.0對實驗結果進行分析，比較各因素對紅曲霉1001產紅曲紅色素的影響。

表2 Plackett－Burman實驗設計及實驗結果Table 2 Plackett－Burman experimental design and experimental results

表3 各因素重要性排序和效應值Table 3 The order of importance and the value of various factors

表4 各因素對色素產量影響情況表Table 4 Table of various factors on pigments content

圖7 不同濃度玉米漿對色素產量的影響Fig.7 Effect of different concentrations of corn syrup on pigments content

由表3可以得出，C、A、H、G對提高紅曲紅色素的產量有顯著正效應，F、D、E、B則具有負效應。其中G、B、H、E對結果的影響很小，A對結果影響較大，而F、D、C對結果的影響最大。

由表4可知，該模型的p=0.0025?0.0500，僅有0.25%的概率不能用該模型來解釋，A、C、D、F、H的p值均小于0.05，說明因素對模型影響顯著。預測R2=0.9947也能合理地說明校正決定系數的變化。總之，該模型能夠很好地表明各因素的變化情況。在本實驗中，對紅曲紅色素有極顯著影響的因素包括KH2PO4、黃豆粉、NaNO3。其中黃豆粉有顯著正效應，KH2PO4、NaNO3有顯著負效應。因此，后面的實驗主要考察了這3個因素，且應適當增加黃豆粉含量，減少KH2PO4、NaNO3的含量。

2.6 最陡爬坡實驗

響應面擬合方程只有在考察的臨近區域內才能夠更接近真實情形，在其他區域內擬合方程與被近似的函數方程毫無關系，毫無意義可言，不值得應用［6］。因此，首先逼近最佳值區域才能夠建立有效的響應面擬合方程。最陡爬坡法是以實驗值變化的梯度為爬坡方向，根據各個因素效應值的大小來確定變化步長，更快捷地逼近最佳值區域，從而可以確定主要影響因素的變化水平［7］。根據Plackett－Burman實驗分析的結果篩選出影響紅曲紅色素的顯著因素，并以各顯著因素的正負效應確定下一步實驗的最陡爬坡路徑(包括變化方向和變化步長)，快速的逼近最佳值區域。由Plackett－Burman實驗結果可知，在紅曲霉1001產紅曲紅色素的液體發酵中，KH2PO4、NaNO3及黃豆粉這三個因素有顯著影響，其中，黃豆粉有顯著正效應，應向增加用量的方向爬坡;KH2PO4，NaNO3有顯著負效應，應向減少用量的方向爬坡。根據這三個因素效應大小的比例設定它們的變化方向及步長進行實驗，實驗設計及結果如表5。

表7 Box－Benhnken Design實驗回歸模型方差分析表Table 7 Box－Benhnken Design experiments regression model variance analysis table

表5 最陡爬坡實驗設計及實驗結果Table 5 Steepest ascent experimental design and experimental results

由表5可知，第3組的色價最高，因此以第3組條件為中心點進行響應面分析。

2.7 Box－Benhnken Design實驗

Box－Benhnken Design設計法是一種利用合理的實驗設計并通過得到的實驗數據，采用多元二次方程來擬合因素和響應值之間的函數關系，以對回歸方程進行分析來尋求最優的組合，從而解決多變量問題的統計學方法［8］。根據PB實驗及最陡爬坡實驗的結果來確定Box－Benhnken Design實驗的因素及水平。以KH2PO4、NaNO3和豆粉三個重要因素為自變量，考察這三個因子的相互作用和最佳水平。根據中心復合實驗設計原理，設計3因素3水平共15個實驗點的響應面分析實驗，在中心值重復3次實驗，Box－Behnken實驗設計及實驗結果見表6。

由表7可知，“Prob＞F”小于0.0500就意味著模式可行，在本實驗中，在模型的各參數中，除A、BC和C2對紅曲色素無影響外，其他各項均有顯著的影響(可信度＞90%)。方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，失擬項0.0562＞0.05，失擬項不顯著。該模型R2=96.41%，說明該模型與實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗可以得到各因素效應值大小排序為:C＞B＞A，即黃豆粉＞NaNO3＞KH2PO4。通過軟件對實驗數據進行二次多項式回歸擬合，獲得產紅曲色素對編碼KH2PO4、NaNO3和黃豆粉多元回歸方程為:色價(Y)=417－8.87A+9.75B+10.38C－27AB －13.75AC+0.50BC－39.13A2－20.88B2+3.38C2。

表6 Box－Behnken實驗設計及實驗結果Table 6 Box－Behnken experimental design and experimental results

根據上述回歸方程及回歸模型方差分析表繪出雙因子效應分析圖見圖8～圖10。各因素及其交互作用對響應值的影響結果可通過該組圖直觀反映出來，分別顯示了三組以紅曲紅色素的色價為響應值的趨勢圖，從等高線圖可以直觀的反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。由紅曲色素響應面三維圖可以看出，黃豆粉、NaNO3、KH2PO4這三個因素均能形成較好的交互作用關系。

圖8 KH2PO4與NaNO3交互影響紅曲紅色素產量的曲面圖Fig.8 Response surface plot for the effects of KH2PO4and NaNO3on Red yeast rice content

圖9 KH2PO4與黃豆粉交互影響紅曲紅色素產量的曲面圖Fig.9 Response surface plot for the effects of KH2PO4and soybean powder on Red yeast rice content

圖10 NaNO3與黃豆粉交互影響紅曲紅色素產量的曲面圖Fig.10 Response surface plot for the effects of NaNO3and soybean powder on Red yeast rice content

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果為:KH2PO4為1.52g/L，NaNO3為0.51g/L，黃豆粉為35.00g/L時，響應面最優值為439.074U/mL。在響應面分析法優化的最佳條件下進行3次平行實驗，得到紅曲色素的色價平均值為437.73U/mL，預測值與實際測量值非常接近，說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好，比優化前色素色價提高了1倍。

3 結論

3.1 本文在基本發酵培養基的基礎上，采用單因素實驗，對碳源、氮源、無機鹽及生長因子進行了篩選，篩選得到了發酵培養基的基本成分:大米粉、葡萄糖、黃豆粉、KH2PO4、NaNO3、MgSO4、玉米漿。

3.2 采用Plackett－Burman實驗設計從7種紅曲霉發酵培養基組分中篩選出了三種最為重要的影響因素，分別為:黃豆粉、KH2PO4、NaNO3。為了以最合理簡便的方法尋找響應面實驗的中心點，采用最陡爬坡實驗逼近中心點，結果表明最優的中心點為KH2PO42.00g/L、NaNO30.4g/L、黃豆粉 25.00g/L。進一步采用Box－Benhnken Design響應面方法分析，得出回歸模型存在最大值點，此時為 KH2PO41.52g/L，NaNO30.51g/L，黃豆粉35.00g/L，紅曲紅色素色價平均為437.73U/mL，比優化前提高了1倍。

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