響應面法優化黑加侖花色苷脂質體制備工藝的研究

趙圣書，王振宇

(東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040)

花色苷是一類花色素與糖以糖苷鍵結合而成的類黃酮化合物，具有C6-C3-C6骨架。花色苷具有抗氧化、清除自由基，減少低密度脂蛋白(LDL)、抗突變、抗腫瘤、改善視力作用等功能［1-2］，可廣泛應用在食品、藥品、化妝品等領域。花色苷對光，溫度等外界條件較敏感，穩定性較差［3］，導致產品中花色苷含量降低，影響了產品的質量和實際使用效果;花色苷是水溶性色素，在腸道中吸收性不強，因此花色苷的穩定性與生物利用率成為在其實際利用中的問題。目前已有研究將花色苷制備成花色苷微膠囊，或者對花色苷進行改性及輔色研究，提高了花色苷的穩定性。而如何在避免改變花色苷的結構的情況下，提高花色苷的穩定性及生物利用率是一個難題。研究發現，以脂質體作為藥物的載體，可以解決以上問題，利用脂質體包埋藥物以減少藥物損失，提高藥物穩定性，促進人體吸收利用。脂質體結構類似生物膜，具有兩性性質［4］，脂質體劑型具有穩定性高、緩釋效果好、靶向性高、利于藥物吸收、降低藥物毒性和副作用的特點［5-7］。制備脂質體的常用方法有薄膜法，乙醇注入法，凍融法，逆向蒸發法，高壓均質法，復乳法等［7-12］。本文利用脂質體將花色苷進行包覆，擬通過薄膜法結合超聲法制備花色苷脂質體，以解決薄膜法制備脂質體粒徑大及超聲法制備包封率不高的問題;以大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，通過對磷脂與膽固醇的比、花色苷濃度、制備溫度及大豆卵磷脂的添加量與包封率關系的研究，結合響應面方法進行優化，進而探求花色苷脂質體制備的最有配方，獲得穩定性好，生物利用率高的脂質體。為開發花色苷新劑型，擴大其在保健食品行業的應用提供一定的理論依據和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花色苷 從黑加侖中分離純化獲得，哈爾濱工業大學食品科學與工程學院生物分離工程實驗室提供;黑加侖 產地大興安嶺，純度92.73%，分子構成為:花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-呋喃阿拉伯糖甙，芍藥素-3-呋喃阿拉伯糖甙;PBS緩沖溶液 上海銳聰科技，純度98%;氯仿、乙醇、正辛醇 分析純;大豆卵磷脂 Sigma公司，色譜純;膽固醇 北京奧博星生物技術責任有限公司。

KQ3200型水浴型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 取0.5g花色苷，以60%乙醇溶解定容于50mL作為花色苷原液。取2mL原液以PBS緩沖溶液(pH7.4)定容至25mL作為樣液。取1mL樣液分別用PBS稀釋成不同濃度，在最大波長531nm下測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線。其中樣液的花色苷含量以pH示差法測定［13］。花色苷濃度與吸光度的回歸方程為:y=47.045x-0.0184，相關系數R2=0.9949，表明花色苷濃度和吸光度在0.005～0.032mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

圖1 花色苷PBS溶液標準曲線Fig.1 Standard curve of anthocyanin

1.2.2 花色苷含量測定 取花色苷脂質體懸濁液，用PBS緩沖液稀釋三倍于5mL離心管中，14000r/min離心30min，取上清，相同條件下離心，再取上清離心，重復三次。以相同條件制備的空白脂質體為空白對照品，測定上清液的吸光度，帶入標準曲線，得到花色苷的濃度。

1.2.3 脂質體制備工藝流程 取0.1g大豆卵磷脂，0.025g膽固醇溶于10mL氯仿中，40℃旋轉蒸發除去有機溶劑，使瓶壁上形成均勻的薄膜。在氮氣保護條件下加入PBS緩沖液(pH7.4)5mL、花色苷樣液2mL、0.5g玻璃珠，水浴超聲使膜脫落后加入10mL PBS緩沖液，40℃減壓旋轉30min，放置2h使花色苷脂質體充分水化，轉移定容至25mL，依次過0.45、0.22μm濾膜，即得花色苷脂質體懸濁液。相同條件下以PBS緩沖液代替花色苷樣液2mL作為空白對照品。

1.2.4 響應面法工藝參數優化 對制備溫度、花色苷加入量、卵磷脂:膽固醇、卵磷脂加入量進行單因素實驗，根據實驗結果，以總花色苷含量為指標，卵磷脂:膽固醇、溫度、花色苷為自變量，設計三因素三水平17個實驗點的響應面分析實驗，因素水平編碼見表1。

1.2.5 數據處理及分析 利用Design Expert8.0軟件中的多元線性回歸分析程序，擬合二階多項式方程，對回歸方程的系數進行顯著性比較(F檢驗)，研究選取因素對花色苷脂質體制備的影響。再利用Design Expert8.0將獲得的二階多項式方程轉化為響應曲面，進一步分析實驗因素及水平對響應值的影響。

表1 中心復合旋轉實驗因素水平編碼表Table 1 Coded factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.2.6 包封率的計算 包封率(%)=(1-Cf/Ct)×100，Cf為游離花色苷含量，Ct為總花色苷含量。

2 結果與討論

2.1 不同因素對花色苷脂質體包封率影響

2.1.1 大豆卵磷脂加入量對包封率的影響 固定卵磷脂∶膽固醇比例4∶1，花色苷量0.08mg，制備溫度40℃，考察卵磷脂添加量 5、10、15、20、30、40mg/mL對包封率的影響，結果見圖2。磷脂分散在水中形成囊泡，每一層均為磷脂雙分子層，因此大豆卵磷脂的加入量關系到脂質體的成膜。由圖2可以看出，卵磷脂的濃度為5～10mg/mL時，磷脂雙分子層內水相包裹了花色苷，脂質體包封率升高;當達到10mg/mL時內水相的容積達到飽和，此時包封率最大;隨后磷脂量增加，包封率下降;卵磷脂加入量到20mg/mL以后，包封率變化不明顯。由此看出，當卵磷脂添加量為10mg/mL時包封率最高，為60.50%。

圖2 卵磷脂添加量對包封率的影響Fig.2 Effect of lecithin content on the entrapment efficiency

2.1.2 花色苷加入量對包封率的影響 固定卵磷脂∶膽固醇 4∶1，卵磷脂添加量固定 0.1g，制備溫度40℃，考察花色苷量 0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24mg對包封率的影響，結果見圖3。花色苷作為一種水溶性藥物，其添加量對脂質體包封率有影響。花色苷添加量為0.04～0.12mg時，花色苷被包封于內核水相中，脂質體的包封率提高;在花色苷加入量為0.12mg時包封率達到最大，脂質體內水相包裹能力達到飽和;隨后花色苷添加量在0.12～0.16mg時，脂質體的包封率下降，0.16mg后包封率趨于平穩，這可能是由于脂質體水相及油相的重新分配，花色苷析出，導致了趨勢的下降。由此看出，當花色苷添加量為0.12mg時包封率最高，為67.08%。

圖3 花色苷加入量對包封率的影響Fig.3 Effect of anthocyanin content on the entrapment efficiency

2.1.3 卵磷脂:膽固醇對包封率的影響 固定卵磷脂添加量0.1g，花色苷量0.12mg，制備溫度40℃，考察卵磷脂∶膽固醇 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 對包封率的影響，結果見圖4。卵磷脂與膽固醇的比對脂質體包封率有影響，是由于膽固醇帶羥基的極性頭部與卵磷脂親水的頭部和兩條平行的疏水尾部相互間隔定向排列，形成脂膜，膽固醇對脂膜有雙向調節作用。國內外已有文獻及預實驗結果，卵磷脂∶膽固醇在1∶1～5∶1 時包封率較高。如圖，當卵磷脂∶膽固醇從1∶1～2∶1 時，包封率上升，并且在 2∶1 時包封率達到最大;隨后卵磷脂:膽固醇繼續變大，包封率反而下降，并在5∶1時達到平衡。這種變化是由于膽固醇使膜微黏度提高，雙分子層更穩定牢固，當膽固醇所占比例過大時，破壞了規律的雙分子層，組成的磷脂質過少，成膜困難，穩定性差，使包埋藥物泄露，包封率下降，由此可以看出，當卵磷脂:膽固醇為2∶1時包封率最高，為71.60%。

圖4 卵磷脂:膽固醇對包封率的影響Fig.4 Effect of phospholipids/cholesterol ratio on the entrapment efficiency

2.1.4 溫度對包封率的影響 固定卵磷脂∶膽固醇2∶1，卵磷脂添加量 0.1g，花色苷量 0.12mg，考察制備溫度30、40、50、60、70℃對包封率的影響，結果見圖5。溫度對花色苷脂質體的包封率有影響，這是由于脂質體的物理性質同介質溫度有密切關系。升高溫度時，脂質體雙分子層的疏水鏈從有序排列變為無序排列，因而引起了膜物理性質的系列變化，即發生了相變，這時有液態、液晶態和晶態共存，而膜的通透性變大，被包裹的藥物滲漏。如圖，當溫度從30～50℃增大時，包封率上升，并于50℃達到最大，超過這個溫度后包封率減小。除此之外，過高溫度會造成花色苷的降解，而過低溫度成膜時間長且不均勻。由此看出，當制備溫度為50℃時包封率最高為70.88%。

2.2 響應面實驗結果

圖5 溫度對包封率的影響Fig.5 Effect of preparation temperature on the entrapment efficiency

表2 中心復合旋轉實驗設計方案及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and its results

2.2.1 響應面法實驗數據處理及數值分析 為了確定最佳制備條件，在單因素實驗基礎上進行中心組合實驗(Box-Behnken)，實驗設計方案和結果見表2，17個實驗點分為兩類:析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點，共有12個;零點，為區域中心點，零點實驗重復5次，用來估計實驗誤差。

以花色苷脂質體包封率為響應值，經回歸擬合后，各實驗因素對響應值的影響可以用下列函數表示:

進一步對回歸方程進行分析，其系數顯著性結果見表3。

從表3可以看出，此模型p＜0.01，響應面回歸模型達到極顯著水平。相關系數R2=0.925505，表明92%的數據可以用模型方程解釋。由表3可以看出，影響包封率的因素主次順序為X2＞X1＞X3。模型中對包封率的影響極顯著(p＜0.01)，X1X2對包封率的影響顯著(p＜0.05)，失擬項不顯著(p＞0.05)，因此該二次方程中實際值與預測值吻合度較高。

從回歸方程中看出:卵磷脂:膽固醇、溫度與包封率呈負相關;也就是說卵磷脂用量相對膽固醇越少效果越好，膽固醇用量越大越好。通過對函數的分析可以看出，卵磷脂:膽固醇在1.5∶1～2.0∶1之間，包封率可以達到74%以上。當制備溫度升高時，脂質體雙分子層發生了相變，導致膜的通透性變大，被包裹的藥物滲漏。因此制備溫度在一定范圍內越低越好。

2.2.2 顯著交互作用對脂質體包封率的影響 為進一步考察3個因素兩兩之間的交互作用對脂質體包封率的影響，對其響應面曲線以及等高線圖進行分析，從圖中可以直觀看出優化區域，并可以在優化區域內根據脂質體制備過程中的實際需要調整各因素的數值大小，從而得到包封率較高的花色苷脂質體。如圖6～圖8所示。

圖6 卵磷脂∶膽固醇和溫度的交互作用Fig.6 Interactions between phospholipids/cholesterol ratio and temperature

由圖6可知，響應曲面的坡度較陡，表明響應值對卵磷脂:膽固醇和溫度的改變較敏感;等高線比較密，說明溫度的變化對脂質體包封率的影響比卵磷脂:膽固醇的變化對包封率的影響大。當花色苷量為0.12mg/mL時，卵磷脂:膽固醇與溫度的交互作用不顯著。由曲面圖可知，在一定的溫度范圍內，隨著溫度的升高，包封率增加;溫度超過一定范圍后，包封率下降，可能是溫度過高時，花色苷發生了降解，導致包封率的下降。當卵磷脂:膽固醇在1.5∶1～2∶1之間，溫度在45～50℃時，對花色苷脂質體制備最有利，預測包封率為74.53%。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance Analysis and parameter estimation of the quadratic response regression model

圖7 卵磷脂∶膽固醇和花色苷量的交互作用Fig.7 Interactions between phospholipids/cholesterol ratio and anthocyanin content

圖8 花色苷量和溫度的交互作用Fig.8 Interactions between anthocyanin content and temperature

由圖7可知，從等高線的疏密程度可以看出，花色苷量變化對包封率的影響比卵磷脂:膽固醇的變化影響大。在提取溫度為50℃時，兩者交互作用較顯著，因為等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩個因素相互作用較顯著。這表明適當增加花色苷量利于包封率的提高。當卵磷脂:膽固醇在1.5∶1～2∶1，花色苷量在 0.12～0.14mg 時，對花色苷脂質體制備最有利，預測包封率為74.47%。

由圖8可知，響應曲面的坡度較陡，表明響應值對溫度和花色苷量的變化較敏感。從等高線的疏密程度可以看出，溫度變化對包封率的影響比花色苷量的變化影響大。在卵磷脂:膽固醇為2∶1時，兩者交互作用較顯著。這表明，在本實驗水平范圍內，適當增大花色苷加入量有利于包封率的提高。當溫度在45～50℃之間，花色苷量在0.12～0.14mg時，對花色苷脂質體制備最有利，預測包封率為74.48%。

2.4.3 優化提取工藝參數的驗證 為了進一步確證計算機模擬得到最佳點的值，對所得的回歸方程取一階偏導等于零并整理得:X1=-0.21，X2=-0.12，X3=0.06，Y=74.5436%。對應的實驗條件:卵磷脂:膽固醇 1.79∶1(mg/mg)、溫度 48.80℃、花色苷量0.12mg，包封率為74.54%。失擬為0.8279＞0.05，以所得最佳反應條件進行實驗，測得包封率為72.9%，與模擬計算機值基本接近，表明預測值和真實值之間有很好的擬合性，進一步驗證了模型的可靠性。

3 結論

大多數水溶性藥物脂質體的包封率低，因此使其作為新興藥物載體而得以應用的基本條件之一就是獲得包封率高且均勻穩定的脂質體。本研究采用薄膜-超聲法制備花色苷脂質體，著重對制備工藝參數進行優選，結合響應面實驗優化，確定最優的制備工藝條件，花色苷脂質體包封率可達74.54%。

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