真空滲透離心法提取燕麥抗凍蛋白工藝的研究

金 濤，張 英，任 瑋，張艷杰，張 暉，錢海峰，齊希光，王 立，*

(1.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122;2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027)

抗凍蛋白(Antifreeze Proteins，AFPs)又叫熱滯蛋白(Thermal Hysteresis Prioteins，THPs)，最顯著的特性是其具有熱滯活性(Thermal Hysteresis Activity，THA)［1］，能夠降低水溶液的冰點，但對熔點的影響較小，從而導致水溶液的熔點和冰點之間出現(xiàn)一定的差值。另外，AFPs還具有其他兩個重要特征:冰晶形態(tài)效應和重結(jié)晶抑制效應［2］。有關抗凍蛋白的研究主要集中于動物抗凍蛋白方面，最先從魚類中發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白［3］;對于植物抗凍蛋白的研究相對較少，而像燕麥籽粒這樣具有較硬外殼的、不易提取的研究更少。本研究對真空滲透離心法提取燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白進行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥 購自于當?shù)爻?六磷酸葡萄糖(G6P)、NADP·Na4、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、檸檬酸 分析純;緩沖液 Tris-HCl;PBS，Na2HPO4-檸檬酸(pH7.4;50mmol/L Na2HPO4∶25mmol/L 檸檬酸溶液(v/v)=18.17∶1.83)。

DSC-7差熱分析儀 Perkin Elmer Pyris;UV7504紫外光分光光度計 上海市實驗儀器總廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)外體蛋白的提取 提取方法參考Smallwood等［4］報道的方法，實驗中略微做了改動。低溫下保存的燕麥用去離子水沖洗3次后，用濾紙吸取表面多余的水分，將燕麥裝入燒杯，用3倍體積預冷的緩沖液(50mmol PBS，pH8.0)浸泡一定時間，再將燒杯放入真空干燥器中，抽真空至一定真空度。維持一段時間后，將氣壓緩慢恢復到正常大氣壓水平，室溫下放置5min，讓多余的提取液流出。用濾紙輕輕吸干，然后將燕麥放入合適的離心管中，離心，上清液再通過高速旋轉(zhuǎn)冷凍離心機10000r/min離心15min，上清液即為燕麥質(zhì)外體蛋白提取液。

1.2.2 總蛋白的提取 參考周露等人［5］關于水稻幼苗質(zhì)外體蛋白的方法。稱取燕麥50g，用預冷的緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，pH7.5)100mL浸泡放置冰箱中冷藏12h，冰浴將燕麥保持低溫狀態(tài)進行初步搗碎，再加入液氮研磨，研磨時加入0.4g SiO2。收集研磨后的粉末并加入100mL的緩沖液(100mmol/L Tris-HCl pH7.5，含 0.2mol/L KCl，20mmol/L MgCl2，2mmol/L EDTA，1%TX-100，5mmol/L DTT，1mmol/L PMSF)來提取蛋白。用超聲波細胞粉碎器裂解細胞，每次超聲的時間為10s，兩次超聲的時間間隔為60s，共超聲 10次。然后將組織勻漿于 25℃，16000g，離心30min，取上清，即為蛋白提取液。

1.2.3 蛋白提取率檢測 采用Bradford方法進行蛋白提取率測定［6］，以標準牛血清白蛋白(BSA)為標準物，繪制標準曲線。再測定同等條件下待測樣品在595nm處的吸光光度值，根據(jù)測得的吸光光度值，即可計算出待測樣品的蛋白含量。

1.2.4 G6PDH酶活檢測 六磷酸葡萄糖脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)活性檢測是通過檢測5min內(nèi)340nm吸收峰的變化情況來判斷［7］。按照1mL的反應體系配制測活反應液:將 850μL pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl，50μL 10mmol/L MgCl2，50μL 60mmol/L G-6-P，50μL 20mmol/L NADP·Na4充分混勻后，向上述反應液中加入50μL的質(zhì)外體蛋白或者總蛋白提取液，迅速混勻，立即監(jiān)測340nm處吸光光度值(A340)的變化，通過上升斜率計算反應速度，以此計算酶活效率，并設置不含蛋白提取液的對照來進行校正。樣品污染率計算見式(1)，酶活力單位的計算見式(2)。

式中，Vt:反應液總體積，本實驗為0.85mL;ΔA/Δt:每分鐘吸光度變化值，實際根據(jù)初速度法取酶促反應第一分鐘的ΔA，先后測3個平行樣取平均值;e:摩爾吸光系數(shù)，NADH在340nm處的毫摩爾消光系數(shù)為6.22;L:比色杯光徑(cm)，本實驗中采用光徑0.5cm的比色杯;Vs:樣品體積，本實驗為0.05mL。因此可得式(3)。

1.2.5 DSC法測定樣品THA THA反映了樣品冰點和熔點之間的差別，要準確的測定THA，首先要解決的問題就是避免溶液發(fā)生過冷現(xiàn)象，采用DSC法對樣品進行退火處理，可以有效避免過冷狀態(tài)發(fā)生。將10μg樣品密封于鋁制坩堝中，放置在樣品池中央，當設備穩(wěn)定后，首先降溫至-30℃，然后升溫至25℃，再降溫至-30℃，記錄體系結(jié)晶熱(ΔHm)和樣品熔點(Tm)。接著，緩慢升溫至樣品體系為固液混合物的狀態(tài)，稱為保留溫度(Th)，停留2min，再將溫度從Th降低至-30℃，重復上述過程，在不同的Th下停留2min，分別記錄不同Th下樣品體系開始結(jié)晶的溫度(To)，以及結(jié)晶熱(ΔHf)。以純水作為對照。冰晶含量(Φ)和THA分別為式(4)、(5)。

式中，Φ為樣品中的冰晶含量;ΔHf為保留溫度停留后繼續(xù)降溫過程中體系的放熱焓;ΔHm為樣品結(jié)晶的總放熱焓［8］。

式中，THA為樣品的熱滯活性，Th為保留溫度，To為不同保留溫度下體系的開始結(jié)晶溫度。

1.2.6 水分、灰分、蛋白質(zhì)含量的測定 分別參照GB5009.3-2010、GB5009.4-2010、GB5009.5-2010。

1.2.7 實驗設計 在燕麥質(zhì)外體蛋白的提取過程中，緩沖液的種類、浸泡的時間、真空度、真空時間對燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白提取都有很大的影響。因此，本文蛋白提取率以及蛋白的污染程度為指標，考察了緩沖液種類、浸泡時間、真空時間、真空度、離心時間、離心轉(zhuǎn)速等6個因素對蛋白質(zhì)提取率以及樣品污染率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 燕麥的基本成分

經(jīng)測定，燕麥的水分含量、灰分含量和蛋白質(zhì)含量分別為10.07%、1.56%和10.58%。

2.2 緩沖液種類對蛋白質(zhì)提取率以及樣品污染率的影響

Tris-HCl、PBS和Na2HPO4-檸檬酸是幾種常用的緩沖液，因此采用此三種緩沖液為基礎緩沖液，并采用上述方法測定其蛋白濃度，計算提取效率結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，使用 Tris-HCl、PBS、水、Na2HPO4-檸檬酸作為緩沖液，蛋白質(zhì)提取率分別為0.034、0.058、0.019、0.050mg/g。可見采用 PBS 緩沖液浸泡的燕麥蛋白提取率較其他三種更高，其蛋白提取率比Tris-HCl、水和Na2HPO4-檸檬酸分別提高了70.6%、205.2%和16%。

圖1 不同緩沖液對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of buffer on the extraction efficiency of proteins

由圖2可以看出，通過計算質(zhì)外體蛋白的酶活活性與總蛋白酶活活性的比值，計算得到樣品的污染率［5］。Tris-HCl、PBS 和 Na2HPO4-檸檬酸的蛋白提取液污染率分別為2.7%、1.3%和2.7%。經(jīng)t檢驗分析3種蛋白提取液的污染率之間沒有顯著差異。而據(jù)相關文獻報道，污染率低于3%即可視為無明顯污染［9］。而這3種提取液的污染率均遠遠低于此標準，采用PBS為緩沖液得到的提取液的污染率略低與另兩種，提取到的質(zhì)外體蛋白純度較高，所以選PBS為緩沖液。

圖2 不同緩沖液種類對質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.2 Effect of buffer on the contamination ratio in the apoplast protein

2.3 浸泡時間對蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

由于燕麥籽粒有殼層包裹，直接抽真空無法提取到較多的質(zhì)外體蛋白，故實驗設計先使燕麥在緩沖溶液中浸泡一定時間，使緩沖溶液充分的滲透，進而再抽真空。選取15、30、45、60、75、90min 6 個時間段研究提取到質(zhì)外體蛋白的最佳浸泡時間。

由圖3可以看出浸泡時間為60min，蛋白提取效率達到最高。在15～60min浸泡時間內(nèi)，蛋白提取率提高較為明顯;60～90min浸泡時間內(nèi)，蛋白質(zhì)得率幾乎沒有變化，說明在浸泡時間在60min左右時，緩沖液已完全滲透。

圖3 緩沖液浸泡時間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of soaking time on the extraction efficiency of proteins

由圖4得，在浸泡時間為 45、60、75、90min時蛋白質(zhì)污染率均為1.3%，表明不同浸泡時間對質(zhì)外體蛋白質(zhì)的提取幾乎沒有污染，所以綜合蛋白質(zhì)提取率和污染率選取浸泡時間為60min較合適。

圖4 浸泡時間對質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.4 Effect of soaking time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.4 真空時間對蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

真空處理時間的長短對蛋白質(zhì)的提取效率會產(chǎn)生一定的影響，真空時間過長則容易造成細胞膜破裂，從而導致細胞內(nèi)蛋白污染;反之則會使蛋白產(chǎn)率顯著降低，蛋白種類減少。根據(jù)以往文獻［10］報道，一般提取質(zhì)外體蛋白時采用的真空度都是30～40kPa，處理時間是30min。由于燕麥籽粒的外殼不易滲透，實驗中適當延長真空處理的時間，與通常方式的30min相比，60min的蛋白質(zhì)提取率比30min的蛋白質(zhì)提取率提高了17.1%。圖5結(jié)果顯示真空處理時間在60min時蛋白質(zhì)提取率到達最高點，說明延長真空時間對蛋白質(zhì)的提取率有一定的提高。

圖5 真空時間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of vacuum time on the extraction efficiency of proteins

真空時間所影響的主要方面在于對于質(zhì)外體蛋白的污染情況，時間延長會使細胞發(fā)生破裂，由圖6得，真空時間在45min和60min下吸光光度幾乎沒有變化，污染率均為1.3%，而真空時間在75min和90min下的污染率分別是2.7%和4.0%，表明真空時間太長，蛋白質(zhì)污染率會提高，且當真空時間90min時，已經(jīng)超過了3%，說明有明顯污染，因此選擇真空時間為60min。

圖6 真空時間對質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.6 Effect of vacuum time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.5 真空度對蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

由圖7可知，真空度對蛋白質(zhì)的提取率影響比較明顯，真空度為0.20MPa下，蛋白質(zhì)的提取率較低，為0.018mg/g;隨著真空度的升高，提取率顯著提高，但通過與傳統(tǒng)的0.30MPa的真空度相比，0.35MPa的真空度提取率提高了25%。在真空度上升到0.35MPa時，蛋白質(zhì)的提取率到達最大，之后再增加真空度則不會再有明顯提升，因此，在真空度選擇為0.35MPa時蛋白質(zhì)的提取率較高。

圖7 真空度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.7 Effect of vacuum degree on the extraction efficiency of proteins

由圖8可知，真空時間的提高對于蛋白質(zhì)的污染率的提高較真空度對于蛋白質(zhì)污染率的影響更大一些，綜合對蛋白質(zhì)的提取率和蛋白質(zhì)的污染率的影響比較，真空度選擇0.35MPa。

圖8 真空度對質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.8 Effect of vacuum degree on the contamination ratio in the apoplast protein

2.6 離心轉(zhuǎn)速對蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

由圖9可知，在離心轉(zhuǎn)速為3500r/min的情況下，蛋白質(zhì)的提取率最高，比離心轉(zhuǎn)速為2000r/min時的蛋白質(zhì)提取率高220%，而繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速，提取率沒有增加。

圖9 離心轉(zhuǎn)速對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.9 Effect of the centrifugal speed on the extraction efficiency of proteins

由圖10可知，當離心轉(zhuǎn)速在3500r/min時，蛋白質(zhì)的污染率有所提高，可能隨著離心力的增大，細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白隨之離心出來，質(zhì)外體蛋白受到污染。總結(jié)蛋白質(zhì)的提取率和蛋白質(zhì)的污染情況，3500r/min下的提取率較3000r/min稍高，但污染率較高，所以實驗選擇3000r/min。

圖10 離心轉(zhuǎn)速對質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.10 Effect of centrifugal speed on the contamination ratio in the apoplast protein

2.7 離心時間對蛋白質(zhì)提取率以及樣品的污染率的影響

由圖11可知，當離心時間在25min左右時，質(zhì)外體蛋白已基本離心出來，再延長離心的時間對于蛋白質(zhì)的提取率沒有明顯影響。離心時間在25min時蛋白質(zhì)的提取率比離心時間為10min的蛋白質(zhì)提取率高115%。

圖11 離心時間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.11 Effect of centrifugal time on the extraction efficiency of proteins

由圖12可知，不同的離心時間下，所得的吸光度值幾乎沒有變化，污染率均為3.1%，基本無細胞質(zhì)內(nèi)蛋白污染，綜合考慮提取率和污染率，選擇離心25min。

圖12 離心時間對質(zhì)外體蛋白質(zhì)污染率的影響Fig.12 Effect of centrifugal time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.8 驗證實驗

綜上所述，燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白的最佳提取工藝為:燕麥籽粒經(jīng)去離子水多次沖洗凈之后，在50mmol、pH8.0中PBS緩沖液浸泡60min后，0.35MPa下抽真空60min，然后在3000r/min下離心25min，再經(jīng)高速低溫10000r/min離心15min。在此條件下進行驗證實驗得到燕麥質(zhì)外體蛋白提取率為0.085mg/g，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)污染率為1.3%。

2.9 燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白熱滯活性的測定

從表1中可以看出，將停留溫度Th從-4.53℃逐漸升高至-3.88℃，冰晶含量逐漸降低，而熱滯活性逐漸升高。已有的研究結(jié)果認為冰晶含量與Th是密切相關的，Th越接近熔化點，冰晶含量越低;反之亦然。表中也顯示冰晶含量隨著停留溫度的增高而降低，熱滯活性隨著停留溫度的增高而增大，這與已有的研究［11］相符。從圖13中也可以看出:當樣品再次冷卻時，結(jié)晶峰并不光滑，出現(xiàn)延滯現(xiàn)象，即結(jié)晶起始溫度與保持溫度存在差異，這表明燕麥質(zhì)外體蛋白具有熱滯活性，能夠降低冰點。

圖13 燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白的熱滯活性Fig.13 THA of oat apoplast antifreeze protein

表1 質(zhì)外體蛋白的停留溫度、凍結(jié)起始溫度、熔點、冰晶核含量和熱滯活性Table 1 The hold and onset temperatures(Th and To)，the exothermic enthalpy under different hold temperature and the totle system(ΔHf and ΔHm)，the amount of ice nuclei，and the thermal hysteresis activity(THA)of the apoplast antifreeze protein

3 結(jié)論

本研究得到燕麥質(zhì)外體抗凍蛋白的最佳提取工藝為:燕麥籽粒經(jīng)去離子水多次沖洗凈之后，在三倍體積 50mmol、pH8.0PBS緩沖液浸泡 60min后，0.35MPa下抽真空60min，然后在3000r/min下離心25min，再經(jīng)高速低溫10000r/min離心15min，再經(jīng)冷凍，干燥。燕麥質(zhì)外體蛋白提取率為0.085mg/g，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)污染率為1.3%。經(jīng)優(yōu)化工藝提得燕麥質(zhì)外體蛋白質(zhì)經(jīng)DSC檢測，證明所得蛋白具有明顯的熱滯活性，THA為2.07℃。

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